同電荷物質(zhì)促進(jìn)蛋白質(zhì)復(fù)性的研究.pdf

1、蛋白質(zhì)復(fù)性是利用基因重組技術(shù)生產(chǎn)藥用蛋白的關(guān)鍵步驟。本文針對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)性過(guò)程中聚集體的形成,在已發(fā)現(xiàn)的同電荷離子交換凝膠介質(zhì)能夠抑制蛋白質(zhì)聚集、輔助蛋白質(zhì)復(fù)性的基礎(chǔ)上,探索同電荷固相介質(zhì)的性質(zhì)對(duì)其輔助蛋白質(zhì)復(fù)性效果的影響,并對(duì)同電荷聚合物輔助蛋白質(zhì)復(fù)性的機(jī)理進(jìn)行了研究。
　　首先,利用分散聚合法合成了具有不同粒徑的單分散聚甲基丙烯酸縮水甘油酯(PGMA)微球,并在其表面接枝聚乙烯亞胺分子(PEIL/S),制備得到一系列具有不同性質(zhì)的

2、陽(yáng)離子微球。將制備得到的PGMA-PEIL/S微球應(yīng)用于同樣帶有正電荷還原變性的溶菌酶(DR-LYS)的氧化復(fù)性,考察了微球性質(zhì)對(duì)蛋白復(fù)性效果的影響。結(jié)果表明,微球表面的電荷密度是影響同電荷介質(zhì)輔助蛋白復(fù)性效果的關(guān)鍵因素,高電荷密度的微球更有利于促進(jìn)蛋白質(zhì)復(fù)性。此外,微球粒徑越小,其輔助復(fù)性效果越好;微球的配基結(jié)構(gòu)對(duì)其輔助復(fù)性的效果無(wú)影響;同電荷介質(zhì)與尿素在抑制蛋白質(zhì)聚集方面機(jī)制不同,二者具有協(xié)同作用。
　　上述研究表明,同電荷微

3、球的電荷密度與其促進(jìn)蛋白質(zhì)復(fù)性效果正相關(guān),因此本文提出了二次修飾方法以提高PGMA微球的電荷密度。即在PGMA微球表面一次修飾PEIL/S后,再二次修飾2-二乙氨基氯乙基(DEAE)或PEIS。結(jié)果表明,二次修飾微球的電荷密度及BSA靜態(tài)吸附容量相對(duì)一次修飾微球均有大幅提高。相對(duì)于一次修飾微球,二次修飾微球具有更好的輔助復(fù)性效果,體現(xiàn)在更高的復(fù)性收率和更低的介質(zhì)使用量上。同時(shí),具有更高電荷密度的二次修飾微球在復(fù)性中的鹽敏感度更低,故在較

4、高鹽濃度的復(fù)性體系中也能有效地促進(jìn)蛋白質(zhì)復(fù)性。二次修飾微球的配基結(jié)構(gòu)同樣對(duì)輔助復(fù)性效果沒有影響。
　　用聚電解質(zhì)代替荷電微球構(gòu)建均相復(fù)性系統(tǒng),對(duì)該均相的復(fù)性體系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光或濁度測(cè)定,研究蛋白質(zhì)折疊或聚集動(dòng)力學(xué),以揭示同電荷荷電介質(zhì)或聚合物輔助蛋白質(zhì)復(fù)性的機(jī)理。結(jié)果表明,在同電荷聚合物促進(jìn)蛋白質(zhì)復(fù)性中,存在臨界電荷比值Rc(溶液中聚電解質(zhì)與蛋白質(zhì)總電荷比)和臨界聚電解質(zhì)Mc(最低的臨界聚電解質(zhì)分子量),在Rc值及Mc值以上,才能達(dá)