輔助因子促進(jìn)蛋白質(zhì)復(fù)性的研究.pdf

1、蛋白質(zhì)的體外復(fù)性研究不僅對(duì)基因工程重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)具有重要意義，而且對(duì)探索蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊導(dǎo)致疾病的機(jī)理也具有積極的指導(dǎo)作用。本文以變性還原溶菌酶為模型蛋白質(zhì)，研究了不同折疊輔助因子對(duì)促進(jìn)蛋白質(zhì)復(fù)性的作用；復(fù)性動(dòng)力學(xué)特性；以及輔助因子與色譜耦合作用提高蛋白質(zhì)復(fù)性收率的途徑。 首先研究了分子伴侶，固定化分子伴侶以及固定化分子伴侶色譜輔助蛋白質(zhì)復(fù)性特性。結(jié)果表明，在1mol/L的最佳鹽酸胍濃度下，固定化分子伴侶色譜法的最高復(fù)性收率可

2、達(dá)到97％，復(fù)性產(chǎn)率達(dá)到54mg/L.h，是尺寸排阻色譜法的4倍，證明固定化分子伴侶色譜復(fù)性方法在高通量復(fù)性方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)。 為了解明分子伴侶輔助蛋白質(zhì)復(fù)性的動(dòng)力學(xué)特性，建立了分子內(nèi)折疊與分子間聚集的競爭反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型。模型分析表明，分子伴侶的存在可有效抑制聚集體的生成，降低聚集體反應(yīng)級(jí)數(shù)(為2級(jí)反應(yīng))；三磷酸腺苷(ATP)作為多肽鏈釋放驅(qū)動(dòng)劑是十分重要的，GroEL和ATP的同時(shí)作用可提高復(fù)性速率2倍以上；在一定的酶濃度

3、下，添加適當(dāng)GroEL和ATP濃度，可實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的高收率和高速度復(fù)性。 其次研究了人工伴侶系統(tǒng)，即十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)+β-環(huán)糊精(β-CD)促進(jìn)高濃度變性溶菌酶的復(fù)性作用。結(jié)果表明，人工伴侶系統(tǒng)的輔助復(fù)性收率較直接稀釋的自發(fā)復(fù)性提高約70％，比僅有β-CD存在下的復(fù)性提高約40％。動(dòng)力學(xué)分析表明，人工伴侶存在下聚集體的生成為三級(jí)反應(yīng)，與直接稀釋復(fù)性相同；鹽酸胍和人工伴侶的作用都是抑制聚集體的生成，并且兩者具有協(xié)同

4、作用，利用此協(xié)同效應(yīng)，可使高濃度的酶(1mg/mL)獲得高收率復(fù)性(＞80％)。此外，若有人工伴侶的存在，在較低濃度的鹽酸胍條件下就可實(shí)現(xiàn)快速、高收率的蛋白質(zhì)復(fù)性。 根據(jù)上述人工伴侶輔助復(fù)性的研究成果，提出了尺寸排阻色譜與人工伴侶耦合作用促進(jìn)蛋白質(zhì)復(fù)性的耦合復(fù)性方法，并實(shí)驗(yàn)證明該方法的有效性。利用此方法，獲得較高的復(fù)性收率的色譜流速高于單純的尺寸排阻色譜，因此利用耦合色譜有利于提高蛋白質(zhì)復(fù)性產(chǎn)率。另外，該方法還可實(shí)現(xiàn)連續(xù)色譜復(fù)