aids實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)0807

1、1,,HIV/AIDS 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院首都醫(yī)科大學(xué)傳染病研究所魏紅山,要點(diǎn)概述,,2,HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的基本目的,為HIV感染提供確認(rèn)，病程監(jiān)控，以及預(yù)后判定提供依據(jù)為輸血提供安全保障，用于獻(xiàn)血員篩查服務(wù)于自愿咨詢?nèi)藛T，提供自愿健康體檢篩查服務(wù)于特殊的醫(yī)療過程，如器官移植，手術(shù)，輸血前后的篩查治療方案的規(guī)劃與調(diào)整，如耐藥檢測(cè)，分型檢測(cè),3,HIV感染過程中的病原學(xué)及免疫學(xué)標(biāo)志物,HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的

2、病原學(xué)基礎(chǔ),4,法國巴斯德研究所Montagnier和美國人類病毒學(xué)研究所Gallo分離并鑒定，因該項(xiàng)成就Montagnier等人獲2008年度諾貝爾獎(jiǎng)。,5,病毒顆粒基本結(jié)構(gòu)Core核心: Viral nucleic acid (DNA or RNA)Capsid衣殼: Protein shell Core + Capsid = nucleocapsid

3、 (核殼體）Envelope包膜：Spike刺突,Naked virus：裸露病毒: Nucleocapsid = virion. Enveloped virus：包膜病毒:Nucleocapsid + Envelope = virion Special structure：特殊結(jié)構(gòu): e.g. 逆轉(zhuǎn)錄酶,RBC直徑約為10000 nm

4、,HIV 基因組結(jié)構(gòu)及編碼蛋白特征,啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄,核心蛋白（核殼膜）,編碼代謝酶,編碼受體結(jié)合蛋白,,,,,,9200 bp,,,結(jié)構(gòu)基因,env基因：gp120，gp41gag基因：p17，p24,功能基因：,pol基因：逆轉(zhuǎn)錄酶，蛋白酶，整合酶,功能輔助基因：調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因、功能基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá) Vif，Tat，Vpu，Vpr，Rev，Nef,,,HIV基因組,7,Env刺突

5、由3個(gè)gp120亞單位非共價(jià)連接，與3個(gè)gp41亞單位形成的異源性三聚體蛋白位于病毒顆粒的外側(cè)。Gp120與CD4結(jié)合后，暴露輔受體結(jié)合位點(diǎn)，gp120與輔受體CCR5和CXCR4結(jié)合Gp41介導(dǎo)病毒顆粒與細(xì)胞膜的融合，將核殼體釋放到靶細(xì)胞內(nèi)。病毒逆轉(zhuǎn)錄酶 介導(dǎo)RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過核孔轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，形成整合前復(fù)合體。病毒整合酶 催化HIV基因組整合到人體染色體上。轉(zhuǎn)錄形成病毒mRNA。病毒mRNA轉(zhuǎn)移出細(xì)胞核，翻譯成病毒

6、蛋白。Gag蛋白，病毒基因組RNA，env糖蛋白復(fù)合體，以及GagPol前體蛋白組裝病毒顆粒發(fā)生于漿膜側(cè)。Gag蛋白上的頂端正電堿性片層，引導(dǎo)Gag定位與漿膜上的磷脂酰肌醇結(jié)合區(qū)。病毒蛋白與病毒基因組mRNA組裝成新病毒顆粒。伴隨新病毒顆粒的釋放，病毒蛋白酶 清除Gag和GagPol多聚蛋白前體，導(dǎo)致病毒顆粒成熟和釋放。,HIV env基因編碼包膜糖蛋白的基本結(jié)構(gòu),,,9,圖1. env蛋白的三聚體結(jié)構(gòu)及其光譜中和表位的分布.,M.

7、J. van Gils, et al. Virology 2013;435: 46–56,HIV入侵細(xì)胞基本機(jī)制,Klasse PJ. Cellular Microbiology 2012;14:1183–1192.,HIV包膜蛋白細(xì)胞內(nèi)穿行與病毒顆粒的組裝,J Mol Biol 2011;410:582-608,HIV組裝基本機(jī)制,,蛋白酶抑制劑作用靶點(diǎn),J Bio Chem 2012;287:40867-40874,Nature

8、2011;469:424-427,HIV感染過程中的病原學(xué)及免疫學(xué)標(biāo)志物,HIV感染后病毒學(xué)參數(shù)變化特征,HIV感染后感染后，血液中最早可以檢測(cè)的標(biāo)志物是HIV RNA和p24抗原。其中病毒RNA最早可以在感染后2周內(nèi)檢出。隨后滴度逐漸增加，在感染后的2個(gè)月可以高達(dá)200萬拷貝/毫升血漿。同時(shí)出現(xiàn)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。這些免疫反應(yīng)可以控制HIV復(fù)制，并可以大幅度降低RNA水平，使RNA水平達(dá)到一個(gè)恒定的水平，即所謂的調(diào)定點(diǎn)。根據(jù)這個(gè)

9、調(diào)定點(diǎn)的水平可以預(yù)測(cè)隨后感染的病程特征：調(diào)定點(diǎn)水平越高，疾病進(jìn)展就越迅速，就會(huì)越快進(jìn)展到AIDS。相反，調(diào)定點(diǎn)水平越低，疾病的進(jìn)展就越緩慢。在感染的后期階段，RNA水平再次逐漸增加，并在AIDS相關(guān)癥狀出現(xiàn)時(shí)再次達(dá)到一個(gè)很高的水平,14,某公司試劑檢測(cè)HIV/AIDS，相應(yīng)標(biāo)志物的變化特征,AIDS實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)基本方法,診斷性檢測(cè),初篩實(shí)驗(yàn)：IFA、ELISA:1985第一代試劑開始使用確認(rèn)實(shí)驗(yàn)：Western blot，線性印跡,預(yù)

10、后判定性檢測(cè),T細(xì)胞亞群檢測(cè)：流式細(xì)胞儀技術(shù)HIV RNA檢測(cè)：幾種核酸技術(shù),HIV耐藥檢測(cè),表型耐藥：細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)基因型耐藥：序列測(cè)定，雜交技術(shù),,16,初篩實(shí)驗(yàn)：雙抗體夾心ELISA的基本原理,HIV ELISA診斷試劑的歷史沿革,18,19,HIV/AIDS快檢試劑,原理：乳膠凝集、免疫斑點(diǎn)和免疫層析，金標(biāo)法最多，可進(jìn)行全血、血清、以及尿液檢測(cè)特點(diǎn)：費(fèi)時(shí)短、不要求特殊設(shè)備、適用于應(yīng)急和基層使用，最大缺點(diǎn)是價(jià)格高，敏感度和特異

11、度低于EIA，不適于城市內(nèi)的血液篩查。,,20,確認(rèn)實(shí)驗(yàn)：Western blot基本流程,美國CDC：2條帶應(yīng)該分別是gag和env基因產(chǎn)物WHO：可以是env基因產(chǎn)物兩條帶美國紅十字會(huì)：應(yīng)該至少gag, env, pol基因各顯示1條帶,確認(rèn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定,22,一旦確診感染HIV，重要的是對(duì)病情進(jìn)行監(jiān)控，并給予合理抗病毒治療，以延緩病情的進(jìn)展。病毒抗原檢測(cè)－－－最早用于預(yù)后判斷，但目前已經(jīng)基本被CD4檢測(cè)縮替代，觀察P24抗

12、原應(yīng)該考慮到晚期表達(dá)水平下降的問題。病毒載量檢測(cè) – 直接評(píng)估 HIV-RNA 常用的方法包括 RT-PCR, NASBA, 以及 bDNA. 是目前常用的技術(shù)。T細(xì)胞亞群檢測(cè)是目前判定患者預(yù)后及決定治療方案的重要方法。,預(yù)后判定檢測(cè),,23,T細(xì)胞亞群檢測(cè)的病理依據(jù)及意義,數(shù)量下降：細(xì)胞毒素和自然殺傷細(xì)胞引起。外周細(xì)胞凋亡, 未分化細(xì)胞死亡。淋巴腺空泡和特殊的凋亡。,功能喪失： 分布外周血中的在幼稚和記憶和其它未知功能

13、細(xì)胞變化導(dǎo)致免疫反應(yīng)削弱。,,評(píng)價(jià)免疫功能減退的程度和AIDS進(jìn)程指導(dǎo)治療策略的制訂確定預(yù)防機(jī)會(huì)感染的最佳時(shí)機(jī)監(jiān)控抗逆轉(zhuǎn)錄病毒（ARV）治療、細(xì)胞因子治療和保護(hù)治療性疫苗的療效,24,25,液流系統(tǒng) — 利用鞘液（FACSFlow Sheath Fluid）將細(xì)胞依序送至測(cè)量區(qū)受檢光學(xué)系統(tǒng) — 利用雷射光源、透鏡、光柵、濾片與反射鏡等激發(fā)並收集細(xì)胞產(chǎn)生之螢光與散射光，並導(dǎo)至各探測(cè)器內(nèi)電子系統(tǒng) — 1.將探

14、測(cè)器測(cè)到的光學(xué)訊號(hào)轉(zhuǎn)換為電子訊號(hào)2.分析所輸出的電流訊號(hào)，以脈衝高度(H)、寬度(W)、積分面積(A)顯示3.量化並放大訊號(hào)傳至電腦,流式細(xì)胞儀的基本組成,26,BD FACSCaliburTM 多色分析儀,,,Dichroic Mirrors,Bandpass Filters,,,,,,Detector#1,Detector#2,Detector#3,Detector#4,CD3,CD19,CD45,CD14,CD14,CD14

15、,CD16/CD56,31,,,Suppressor T cell,T cell / B cell,,,CD45 PerCP,SSC,流式細(xì)胞儀T細(xì)胞亞群絕對(duì)計(jì)數(shù)原理,MMWR, 2003: 52(RR02);1-13,32,RT-PCRbDNANASBALCx,HIV RNA檢測(cè)的方法,RT-PCR、NASBA檢測(cè)屬于PCR方法，其中包括抽提RNA的步驟，所以較容易受污染，而使RNA降解bDNA與RT-PCR、NASBA相比較

16、有較好的穩(wěn)定性、線性和可重復(fù)性,,特殊人群：懷疑急性期感染者，母嬰傳播，核酸檢測(cè)能夠提供早于免疫學(xué)指標(biāo)的診斷，已經(jīng)被認(rèn)為是18個(gè)月以下嬰幼兒診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。除早期診斷外，HIV RNA測(cè)定能夠監(jiān)測(cè)HIV慢性感染者病情的發(fā)展。以及作為評(píng)價(jià)HAART治療效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)。應(yīng)用核酸雜交法或應(yīng)用PCR法檢測(cè)HIV的前病毒DNA可確定細(xì)胞中HIV潛伏感染情況。由于其固有的高敏感性，某些國家已經(jīng)采用這種技術(shù)用于獻(xiàn)血員的篩查，被認(rèn)為與經(jīng)典免疫學(xué)篩

17、查方法相比，可以降低輸血傳播約50%。,33,NASBA 技術(shù),NASBA (Nucleic acid sequence-based amplification) 早期產(chǎn)品為NASBA HIV-1 RNA QT定量RNA測(cè)定方法，現(xiàn)已被最新版本的方法NucliSens HIV-RNA QT assay取代。NASBA技術(shù)是一種等溫?cái)U(kuò)增系統(tǒng)，其擴(kuò)增基礎(chǔ)在于系統(tǒng)內(nèi)的混合酶系統(tǒng)，此系統(tǒng)內(nèi)含有逆轉(zhuǎn)錄酶AMV-RT和T7-DNA多聚酶，以在體外

18、模擬逆轉(zhuǎn)錄病毒體內(nèi)復(fù)制過程。,Triton X-100裂解病毒提取核酸加入銣標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)根據(jù)內(nèi)標(biāo)計(jì)算野生株拷貝數(shù),,34,RT-PCR 技術(shù),基本原理是通過逆轉(zhuǎn)錄酶的作用將樣品中RNA逆轉(zhuǎn)錄合成DNA后進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR），方法較為簡(jiǎn)單異硫氰胍裂解液裂解病毒，釋放出核酸成分。加入一個(gè)已知拷貝數(shù)量的合成RNA分子作為定量標(biāo)準(zhǔn)（QS），然后進(jìn)行RNA提取。使用引物在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生142堿基的

19、gag基因片段（DNA），通過PCR方法對(duì)此基因片段進(jìn)行擴(kuò)增。清洗掉未雜交的反應(yīng)產(chǎn)物后再加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的親和素，親和素與擴(kuò)增產(chǎn)物上的生物素結(jié)合HRP的底物進(jìn)行顯色反應(yīng)，測(cè)定OD值。,,35,bDNA 技術(shù),bDNA測(cè)定技術(shù)基于其獨(dú)特的信號(hào)放大系統(tǒng)，即bDNA信號(hào)放大系統(tǒng)，這是一個(gè)人工合成的bDNA，bDNA的分枝可結(jié)合多個(gè)酶標(biāo)記物，從而將病毒的信號(hào)放大，以便進(jìn)行檢測(cè)。此檢測(cè)系統(tǒng)不涉及核酸擴(kuò)增反應(yīng)首先將血漿樣品離心

20、，濃縮其中的病毒顆粒，HIV RNA釋放后加入微孔板中板孔中包被有可與病毒特異結(jié)合的一系列靶探針，靶探針的一端可標(biāo)記在游離的病毒核酸鏈上，另一端可與bDNA結(jié)合，加入酶標(biāo)記物對(duì)結(jié)合的bDNA進(jìn)行標(biāo)記經(jīng)過清洗后加入底物進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)強(qiáng)度,本方法定量系統(tǒng)中沒有內(nèi)標(biāo)記物，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置一系列外部標(biāo)記，通過實(shí)驗(yàn)樣品反應(yīng)強(qiáng)度與外部標(biāo)記樣品強(qiáng)度的比較確定實(shí)驗(yàn)樣品的病毒拷貝數(shù)。,,36,HIV RNA 應(yīng)該在感染后從血清轉(zhuǎn)換至AIDS 全程可以

21、檢測(cè)地到。但實(shí)際感染者中許多血清HIV RNA 水平并不高，有些患者在無癥狀階段甚至低于400 拷貝/毫升。對(duì)于一些敏感性不高的試劑盒，該階段可能會(huì)出現(xiàn)HIV RNA 檢測(cè)陰性的結(jié)果。其它一些因素也會(huì)影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,地理因素感染亞型和循環(huán)中病毒重組的影響病毒變異導(dǎo)致擴(kuò)增引物特異性變化病毒準(zhǔn)種復(fù)雜性,HIV RNA檢測(cè)結(jié)果解讀注意事項(xiàng),37,近期HIV感染患者的識(shí)別:STARSH分析,新近感染的識(shí)別有助于HIV傳播模式的評(píng)價(jià)

22、新近HIV血清學(xué)轉(zhuǎn)換測(cè)試算法（STARSH）是一系列分析方法這些分析方法主要是基于HIV感染后一系列典型的免疫學(xué)事件這些分析方法一旦在HIV特異性抗體生成，并不能鑒別哪些患者是慢性感染者，哪些是新近感染者,總體評(píng)價(jià),38,近期HIV感染患者的識(shí)別:STARSH分析,常用方法,“失調(diào)”分析（detuned assay）該技術(shù)基于HIV感染早期階段誘導(dǎo)機(jī)體所產(chǎn)生的抗體親和力和滴度都比較低，而隨著疾病的進(jìn)展，HIV特異性抗體的親和力

23、和滴度都逐漸升高。因此，聯(lián)合一種高敏感試劑盒和相對(duì)低敏感試劑盒對(duì)標(biāo)本進(jìn)行分析即可達(dá)此目的。BED-捕獲酶免分析（CEIA）BED-捕獲酶免分析是一種商用產(chǎn)品，其原理是基于HIV-特異性IgG抗體占血清總IgG抗體比例，藉此推斷感染大致時(shí)間。早期感染，HIV特異性IgG占總IgG比例較慢性感染低，并隨著感染時(shí)間延長而逐漸增加。,39,近期HIV感染患者的識(shí)別:STARSH分析,常用方法,親和指數(shù)分析這種方法是基于HIV感染越早

24、，HIV抗原與誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體親和力越低的事實(shí)?；诳乖?抗體的親和力指數(shù)對(duì)感染時(shí)間進(jìn)行判定。具體來說，將患者的血清標(biāo)本首先采用離液劑，諸如鹽酸胍，斷開維持抗體二級(jí)結(jié)構(gòu)及與抗原相互作用的氫鍵。然后重新對(duì)抗體親和性進(jìn)行分析。IDE-V3免疫分析IDE-V3免疫分析是一種基于env編碼糖蛋白上的兩個(gè)保守的免疫表位：一個(gè)表位在gp41上，另一個(gè)表位在gp120上的V3區(qū)。根據(jù)不同寡肽的抗體親和模式，可以將感染分為180內(nèi)的感染和180天

25、后的感染,40,STARSH分析受很多因素的影響：主要有以下幾點(diǎn)：,近期HIV感染患者的識(shí)別:STARSH分析,影響因素,HIV的高度變異性仍然是主要因素，不同分離株之間免疫優(yōu)勢(shì)表位的差異，必然影響抗體的差異病程的限制，諸如AIDS階段患者抗體的濃度低下HAART治療的影響，藥物治療可以顯著影響體內(nèi)病毒株的準(zhǔn)種進(jìn)化，因而對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果也有相應(yīng)的影響,41,AIDS目前臨床領(lǐng)域內(nèi)面臨的問題：疫苗&耐藥,不同亞型之間gp120的差異

26、高達(dá)35%. 有效誘導(dǎo)廣譜中和抗體的表位，深埋于蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)部。尚不清楚控制HIV-1復(fù)制免疫反應(yīng)的實(shí)質(zhì)，諸如免疫反應(yīng)的控制，血清陰性患者的高危因素,Taylor, B.S., et al. N. Engl. J. Med. 2008;358:1590–1602.,Barouch, D.H., 2008. Nature 455, 613–619.,Lederman, et al., J. Infect. Dis.2010;202:S3

27、33–S338.,HIV抗病毒治療的目的,延緩病情進(jìn)展恢復(fù)免疫系統(tǒng)的功能改善患者的生存質(zhì)量,HIV抗病毒藥物的分類及方案,核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑：競(jìng)爭(zhēng)逆轉(zhuǎn)錄酶的底物非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑：與逆轉(zhuǎn)錄酶的轉(zhuǎn)錄活性位點(diǎn)p66疏水口袋結(jié)合，阻斷逆轉(zhuǎn)錄酶異位，位點(diǎn)專一高效蛋白酶抑制劑侵入抑制劑和融合抑制劑整合酶抑制劑,高效的抗病毒治療方案需要3種或3種以上藥物聯(lián)合使用。截止2008年3月，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了1種進(jìn)入抑制劑，1種融合抑制劑，1

28、種整合酶抑制劑，17種逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，11種蛋白酶抑制劑。,HIV耐藥產(chǎn)生的原因：,自發(fā)突變-原發(fā)性耐藥藥物壓力選擇-繼發(fā)性耐藥,每天體內(nèi)大約產(chǎn)生1010個(gè)病毒顆粒，每個(gè)核苷酸位點(diǎn)每次復(fù)制變異頻率為3×10-2，多位點(diǎn)變異導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶空間結(jié)構(gòu)變化，使HIV對(duì)藥物不再敏感。,不規(guī)范的治療、不合時(shí)機(jī)的給藥都會(huì)導(dǎo)致耐藥的產(chǎn)生。,HIV耐藥的基本認(rèn)識(shí),44,當(dāng)1種或1類抗HIV藥物不再有效，則被認(rèn)為HIV耐藥。HIV

29、-1耐藥意味著病毒可以在藥物環(huán)境中適應(yīng)，生長，以及復(fù)制。HIV感染者3/4的患者治療失敗與耐藥有關(guān)約1/4的新感染患者已經(jīng)對(duì)至少1類抗HIV藥物耐藥（原發(fā)耐藥）,耐藥產(chǎn)生的分子機(jī)制,蛋白酶抑制劑：1）結(jié)合位點(diǎn)變異導(dǎo)致酶與競(jìng)爭(zhēng)底物（藥物）結(jié)合力降低；2）催化部位變異導(dǎo)致代償性催化活性增強(qiáng)核苷類似物類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑導(dǎo)致的突變多發(fā)生于5’-端編碼區(qū)非核苷類似物：1）逆轉(zhuǎn)錄酶空間構(gòu)象改變；2）增強(qiáng)焦磷酸水解，使DNA合成加速,HIV耐藥

30、檢測(cè)的意義,為臨床提供患者治療方案抉擇的整體信息：病史，病毒載量，以及CD4+T計(jì)數(shù)避免使用已經(jīng)耐藥的藥物，降低患者的副作用及治療費(fèi)用有效治療方案，藥物篩選的依據(jù),何時(shí)進(jìn)行HIV耐藥檢測(cè)？,抗病毒治療前：1）明確原發(fā)性耐藥；2）動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)耐藥進(jìn)展特征治療失敗后：明確何種藥物，或何種方案不再有效全程監(jiān)控：明確耐藥位點(diǎn)動(dòng)態(tài)變化與耐藥表型之間的關(guān)系,那些藥物耐藥？,美國的部分資料顯示,76%的病毒株至少對(duì)一種核苷類似物藥物耐藥對(duì)蛋白酶

31、抑制劑耐藥率40.5%對(duì)非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥率25.2%對(duì)2種或3種治療藥物同時(shí)耐藥率分別為47.1%和13.1%,Richman DD, et al. AIDS 2004;18:1393-1401,我國的部分資料顯示,初治6個(gè)月，耐藥發(fā)生率62.7%新發(fā)患者15%的患者攜帶耐藥株,Zhang X, et al. AIDS 2007;21Suppl8:S53-S57,基因型耐藥檢測(cè),原理：RT-PCR獲取RT、PR基因，然后

32、進(jìn)行分子雜交或核酸測(cè)序。方法：,特異性引物擴(kuò)增差異雜交分析線性探針分析基因芯片分析,48,能夠提供治療方案中每種藥物的耐藥情況，是對(duì)耐藥的直接測(cè)量結(jié)果容易理解對(duì)病史，治療方案復(fù)雜的患者，結(jié)果容易理解便于新藥耐藥分析便于新突變位點(diǎn)的識(shí)別,僅能對(duì)優(yōu)勢(shì)耐藥株的耐藥情況進(jìn)行分析， 1000 copies/ml費(fèi)用較高檢測(cè)周期較長：3~4 周,測(cè)序分析,能直接測(cè)出HIV-1對(duì)藥物的敏感度，并能揭示事先存在或交叉的耐藥情況，

33、有利于指導(dǎo)HIV-1感染者有效地用藥。目前市面上供應(yīng)試劑盒已有2種，即AV（Vicro Antivirogram）和PS（Virologic PhenoSense），兩者方法均應(yīng)用從生長于載體中的HIV-1而獲得的重組病毒和病人標(biāo)本中蛋白酶與逆轉(zhuǎn)錄酶序列，分析與野病毒之間IC50值相差倍數(shù)，一般達(dá)5—10倍以上為陽性。各種藥物引起HIV變異其位點(diǎn)不一樣，這種方法的最大優(yōu)點(diǎn)是可以獲得各種藥物耐藥量度數(shù)據(jù)，但不足的是試驗(yàn)慢又昂貴，技術(shù)要

34、求高。,HIV表型耐藥性測(cè)試方法,52,鑒別混合病毒株中，突變的水平在10%-50%結(jié)果由一定的“預(yù)測(cè)”性，可能在實(shí)際耐藥前檢出實(shí)驗(yàn)周期短：< 2 周費(fèi)用低,需要病毒載量>500~1000 copies/ml難以明確次要病毒株的變異對(duì)結(jié)果的理解需要一定的基礎(chǔ)知識(shí)背景，關(guān)聯(lián)性分析等不同實(shí)驗(yàn)室之間分析方法，對(duì)結(jié)果的理解有差異,虛擬表型分析法,原理：用基因型結(jié)果解釋表型類型。特點(diǎn)：需要建立基因型相關(guān)表型數(shù)據(jù)庫。,能夠

35、把復(fù)雜的基因型資料轉(zhuǎn)化為簡(jiǎn)單的表型資料，便于臨床醫(yī)生理解、決策。對(duì)NNRTIs和PI類藥物預(yù)測(cè)較好；對(duì)NRTIs預(yù)測(cè)較差。需要建立經(jīng)驗(yàn)性數(shù)據(jù)庫。,56,Stanford University HIV Resistance Database: http://hivdb.stanford.edu/ UCSF Database of Antiretroviral Drug Interactions: http://hivinsite.

36、ucsf.edu/insite?page=ar-00-02 HIV Drug Interactions: http://www.hiv-druginteractions.org/,HIV耐藥的預(yù)防,治療方案的依從性是預(yù)防耐藥的關(guān)鍵環(huán)節(jié)：每劑，每次，每天的依從性避免HIV-1感染的傳播，是原發(fā)耐藥株的傳播核心阻斷環(huán)節(jié),AIDS初篩實(shí)驗(yàn)室的管理及質(zhì)量控制,必要性：HIV檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的室內(nèi)質(zhì)量控制與室間結(jié)果比較對(duì)HIV檢測(cè)結(jié)果的持續(xù)改進(jìn)

37、非常重要。這是因?yàn)椋?許多測(cè)試方法可以用于HIV感染或AIDS的診斷。同一HIV測(cè)試方法在不同的實(shí)驗(yàn)室/不同測(cè)試人員往往給出不同的測(cè)試結(jié)果許多影響因素可以導(dǎo)致HIV檢測(cè)結(jié)果的變異：,包括制造商試劑盒的質(zhì)控變化操作人員技術(shù)熟練程度病毒的遺傳變異選擇用于評(píng)價(jià)測(cè)試性能的“金標(biāo)準(zhǔn)”或“參照標(biāo)準(zhǔn)”的使用尤其是測(cè)試前對(duì)HIV陽性的估計(jì),59,AIDS初篩實(shí)驗(yàn)室的管理及質(zhì)量控制,1992年WHO即對(duì)HIV測(cè)試方法的選擇等給出了相應(yīng)的推薦意

38、見，并在1997年對(duì)這個(gè)推薦意見進(jìn)行了修改。2004年我國即出臺(tái)了《全國艾滋病檢測(cè)技術(shù)規(guī)范》(2004年版) 2009年國家CDC針對(duì)標(biāo)本的采集、某些檢測(cè)方法、特殊人群檢測(cè)等問題，對(duì)2004年規(guī)范進(jìn)行了修正，即目前的《全國艾滋病檢測(cè)技術(shù)規(guī)范（2009年版）》。與2004年版相比，該版增加了有關(guān)HIV-1耐用檢測(cè)相關(guān)內(nèi)容及實(shí)驗(yàn)室生物安全及實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理相關(guān)內(nèi)容,HIV實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控管理,60,,2003年9月新加坡國立大學(xué)科研人員在環(huán)境

39、衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)室中感染SARS病毒。2003年12月1名臺(tái)灣的SARS研究人員在“國防預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所”實(shí)驗(yàn)室感染SARS病毒。2004年4月安徽、北京先后發(fā)現(xiàn)新的SARS 病例，經(jīng)證實(shí)分別來自于在中國疾病預(yù)防控制所實(shí)驗(yàn)室受到SARS感染的2名工作人員。,實(shí)驗(yàn)室生物安全問題……,61,AIDS初篩實(shí)驗(yàn)室的管理及質(zhì)量控制,HIV實(shí)驗(yàn)室生物安全管理,1990年2月12日衛(wèi)生部即正式批準(zhǔn)了《HIV檢測(cè)管理規(guī)范》（試行），其中即對(duì)HIV檢測(cè)實(shí)

40、驗(yàn)室的設(shè)置，必要的條件，生物安全等問題給出了明確的規(guī)定。1997年《全國艾滋病檢測(cè)工作規(guī)范》明確要求：二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室基本要求：,HIV相關(guān)血清學(xué)檢測(cè)要在生物安全I(xiàn)I級(jí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行進(jìn)行HIV分離、培養(yǎng)與擴(kuò)增、濃縮與純化、中和試驗(yàn)等檢測(cè)工作的，需要在三級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。,布局上嚴(yán)格劃分為清潔區(qū)、半清潔區(qū)，以及污染區(qū)3個(gè)區(qū)域裝備生物安全柜,62,THANKS,魏紅山首都醫(yī)科大學(xué)傳染病研究所Tel： 10-8432