狂犬病實驗室檢測技術

1、1,狂犬病實驗室檢測技術,,2,一、實驗室操作前的要求及準備二、實驗室檢測方法,,3,實驗室操作前的要求及準備,（一）實驗室條件及生物安全操作要求（二）檢測標本的要求（三）實驗前準備,4,（一）實驗室條件及生物安全操作要求,1、暴露前免疫 工作人員需要暴露前免疫 意外暴露于狂犬病毒時,必需立即報告部門負責人。2、P2實驗室 操作所有潛在狂犬病感染的材料均應在P2 或P3實驗室內(nèi)進行

2、 (實驗室固定毒在P2，病人或動物分離的街毒在P3）。3、P3實驗室 對動物標本進行狂犬病毒分離時，必須在P3 以上條件的專業(yè)實驗室中進行。 沒有P3 實驗室，嚴禁從事狂犬病毒分離工作。,5,4、個人防護 實驗前要穿戴好防護服、眼鏡、手套， 作好技術上的準備。5、防止氣溶膠擴散 由于空氣傳播狂犬病毒已經(jīng)得到證實，因此高速混懸或離心操作應在密閉狀態(tài)下進行。

3、6、實驗后消毒處理 實驗后要作好善后消毒處理, 狂犬病毒對脂溶劑（肥皂水、醚、氯仿、丙酮），45～70%乙醇，碘制劑和四銨化合物敏感，操作完畢對操作臺、實驗材料等要用相應的消毒劑或高壓蒸汽進行消毒處理。,6,1、采集時間 （1）應盡量采集較新鮮的標本。 （2）采集時無菌操作，避免標本污染2、標本保存 （1）盡量低溫保存 （2）存放于無菌離心管中并進行編號。 3、標本類型

4、 （1）唾液、腦脊液、眼角膜、咬傷處皮膚組織、腦組織、血清等。 （2）唾液、腦脊液、眼角膜、咬傷處皮膚組織、腦組織等均可用于 病原學檢測，其中以腦組織中的陽性率最高； 血清和腦脊液可用于抗體的檢測。,（二）檢測標本的要求,7,（三）實驗前準備,1、實驗室及儀器的準備（略）2、各種試劑及材料的準備（略）,8,實驗室檢測方法,（一）DFA 法（二）巢式 PCR 法（三）其

5、它檢測方法（四）狂犬病診斷標準（WS281-2008）中的檢測方法（五）美國 CDC 狂犬病實驗室操作手冊中的檢測方法,9,（一）DFA 法（直接熒光抗體法） ——檢測狂犬病毒抗原,10,熒光抗體的染色方法可分為兩類：直接法 — 熒光抗體直接與標本內(nèi)的抗原反應, 優(yōu)點簡便、快捷、有效減少非特異性染色,

6、 只適用于檢測細胞內(nèi)的抗原；間接法 — 熒光抗體作為第二抗體，與直接結合胞內(nèi)抗原的第一抗體反應, 既可檢測胞內(nèi)抗原，也可以檢測體液中的特異抗體 相對直接法操作步驟增多 DFA原理： 抗體蛋白分子 + + 抗原→形成抗原抗體復合物→通過熒光顯微鏡→檢測抗原 熒光素,,11,操 作：,1、材料和儀器2、操作步驟

7、i. 印片： 用酒精浸泡載玻片 30 分鐘后取出、吹干， 分別取不同部位的腦組織剖面, 均勻的涂印在載玻片上； ii. 固定： 吹干后，取冷丙酮（4℃）室溫固定 7～10 分鐘； 取出吹干，進行步驟3，或置于－ 70℃冰箱保存； iii. 加熒光抗體： 將稀釋好的熒光抗體滴加在固定好的抗原

8、片上 （如果從 冰箱中取出，則待霧氣散掉后再進行此步驟。）；,12,iv. 孵育： 將抗原片放在濕盒中， 37℃溫育30 分鐘； v. 洗片： 取出后，用緩流沖洗抗原片 3～5 秒， 再用 PBS 振洗 2 遍， 蒸餾水振洗 1遍，每次 2 分鐘，吹干； vi. 封片鏡檢： 用 90％甘

9、油（ PBS）封片，加蓋玻片，熒光顯微鏡觀察。,攪拌器及染色缸,13,結果判斷：,仔細觀察每個視野的熒光強度，并結合不同視野的熒光分布，作出熒光強度的等級判斷：陰性、可疑、 ＋~ ＋＋＋＋－：無熒光；＋/－：極弱的可疑熒光；,無熒光“－”,14,＋：熒光較弱，但清晰可見；,15,＋＋：熒光明亮，且多個視野均有分布；,16,＋＋＋～＋＋＋＋：熒光閃亮，可見尼基氏小體清晰，且范圍廣泛；,熒光強度“＋＋＋”

10、 熒光強度“＋＋＋＋”,17,18,（二）巢式 PCR 方法——檢測狂犬病毒核酸,傳統(tǒng)的 PCR 檢測模式一般需要三個步驟：制備模板：對待測標本進行核酸（DNA或 RNA）提取擴增過程：采用 PCR 或 RT-PCR 技術對核酸進行變性、退火、延伸擴增；檢測過程：通過電泳等方法對PCR產(chǎn)物進行檢測。 Sample Extract RNA or DNA

11、 PCR Electrophoresis photograph,19,巢式 PCR（nested－PCR）：,巢式 PCR的原理： 是設計兩對引物，其中一對引物在另一對引物擴增產(chǎn)物的片段上，通過二次 PCR 反應對某個基因進行檢測。通常第一次采用能擴增較大片段的引物，經(jīng)過循環(huán)擴增后，將第一次擴增的產(chǎn)物作為模板進行第二次擴增。 優(yōu)點：

12、特異性、靈敏度均比常規(guī) PCR好。缺點： 比常規(guī) PCR易污染。,20,巢 式 PCR 方法的操作：,1、RNA 提取：Trizol 法 （1）以下步驟在 P2 生物安全柜中進行 取不同位置的少量腦組織（50-100mg）＋ 1000μ l Trizol 先加 200μ l（研磨均勻）然后加滿至 1000μ l [液體（唾液、尿液等）取 250μ l

13、＋ 750μ l Trizol LS] ↓ -70℃過夜或顛倒 Epp 管 30～40 次以便充分混勻內(nèi)容物， 室溫放置 5 分鐘

14、 （此步完可-70℃保存 1 個月）,21,（2） 以下步驟可在普通實驗室進行 -70℃取出，室溫融化→加 200μ l 氯仿， 快速顛倒 Epp 管數(shù)次（30 秒），使其呈淡粉紅色 ↓ 室溫放置 3min ↓ 4℃離心，12000rpm，15min （其間標記新的離心管，每管中加 600μ l 異丙醇） ↓ 取離心后水相 600μ l，加入新的離心管中，輕柔混勻 ↓ 室溫放置 10 min （－20℃放置

15、30 分鐘效果更佳） ↓ 4℃離心，12000rpm，10min ↓,22,緩緩倒掉上清，用槍頭輕輕吸去殘存液體，可見少量沉淀 ↓ 加 1ml 75％乙醇（DEPC H2O 新鮮配制）洗滌沉淀 ↓ 4℃離心 12000rpm，10min ↓ 緩緩倒掉上清，用槍頭輕輕吸去殘存液體，室溫干燥數(shù)分鐘 （加入 75％乙醇至－70℃可長期貯存 1～2 年） ↓ 腦組織的沉淀溶于 70ul DEPC H2O 中(2 個 EP

16、P 管分裝) [液體（唾液、尿液等）的沉淀 溶于 35ul DEPC H2O 中] ↓ 直接進行逆轉錄或－70℃貯存,23,注意事項： 1. 操作時一定戴口罩手套，保證離心管槍頭無 RNA 酶 2. 一次提取核酸，樣本數(shù)不要太多（10 個左右） 3. 加入氯仿后到加入異丙醇之前的操作應盡量快速且作用時間準確， 否則容易降低提取效率 4. 異丙醇和乙醇作用時間略長不影響結果 5. 加入

17、異丙醇后所有的混均操作要輕柔，加液體時貼壁緩流，以免破 壞到所提核酸 6. 盡量縮短 RNA 在空氣及室溫的暴露時間，水溶的 RNA 一定要低溫保存 7. 標本及時放回-20℃或-70℃,24,2、逆轉錄合成cDNA1）pd(N)6 稀釋至 0.2ug/ul2）水浴預熱至 65℃（其間標記反應管） 3）33ulRNA 液 65℃水浴 10min（其間準備冰盒或碎冰）4）冰浴 2min，瞬時離

18、心。5）將液體轉移至試劑盒反應管中 32ul，先不要混勻。6）再向反應管中加入 1ul pd(N)6 0.2ug/ul 或特異引物各 0.5ul，使總體 積達到 33ul，室溫 1min，混勻，瞬時離心。 7）37℃水浴，60min 8） -20℃或-70℃保存 cDNA,25,3、巢 式 PCR：,26,27,瓊脂糖凝膠電泳 1．電泳槽中注入緩沖液 TAE 2．將做好的瓊脂膠放入電泳槽（加樣孔在負

19、極方向） 3．Marker 加 5 ul，樣品加 10ul5．電壓：100V6．時間：30min 照相：凝膠成像儀/紫外透射儀,28,（三） 其它檢測方法,1、ELISA——檢測抗原：包被抗體：用pH 9.6 的碳酸鹽緩沖液稀釋的抗狂犬病毒核衣殼IgG 包被96 孔酶標板，4℃過夜； 封閉：用含0.3％牛血清白蛋白和5% 蔗糖的pH9.6 碳酸鹽緩沖液封閉30分鐘；

20、 加待檢標本：將采集到的標本研磨，用pH 7.4 PBS制成30％的懸液，離心取上清加 入酶標板孔內(nèi)，同時設陰性、陽性對照，200 μ l/孔，37℃孵育1 小時； 洗板：洗板四次；加酶標抗體：后加入純化的酶標記抗狂犬病毒抗體200μl/孔，37℃ l 小時；洗板：同上；加底物：加入酶反應底物，室溫作用30 分鐘；終止反應：加

21、2M H2SO4 終止反應；觀察結果：肉眼觀察或酶標儀測定結果。,29,2、熒光灶抑制試驗——檢測中和抗體,中和抗體： 為疫苗免疫力程度的評判指標 中和抗體水平等于或高于0.5IU/ml 血清，表示能得到有效的保護快速熒光灶抑制試驗（RFFIT）： 為WHO 推薦的檢測方法 制備細胞懸液( 1×10 cells/ml 的 BSR 細胞懸液)

22、 ↓ 稀釋血清和病毒(待測血清、對照血清、標準血清、病毒固定毒CVS 株） ↓ 中和血清和病毒( 0.1ml血清 和標準病毒稀釋液0.1 m1 ，37℃中和1.5 小時) ↓ 檢測剩余病

23、毒(每孔加入 50 µl 制備好的細胞懸液，37℃、5% C02 過夜培養(yǎng)) ↓ 固定(棄掉培養(yǎng)液，PBS 洗一次，丙酮固定) ↓ 熒光抗體檢測(干燥后，加熒光素標記的抗狂犬病毒抗體，37℃ 30 分鐘)

24、 ↓ 觀察結果( PBS 洗3 次，熒光顯微鏡觀察結果) ↓ 計算中和抗體滴度(實驗組中能使熒光灶抑制≥50％的血清最高稀釋倍數(shù)，即為被檢血清的中和抗體滴度),步驟,,30,3、病毒分離,A. 細胞培養(yǎng)法——分離病毒研磨標本 → 制成

25、懸液（用PBS 或MEM ，30％ ）→ 離心（ 4℃ 2000r/min 離心20 m） → 取上清接種細胞（鼠神經(jīng)瘤細胞、Vero 細胞或BHK21 細胞） → 吸附（ 2 h） → 加維持液 → 孵育(37℃ 、5％C02 、4～5 天) → 鑒定B. 乳小白鼠接種法——分離病毒研磨標本 → 制成懸液 → 離心 → 取上清接種乳鼠腦內(nèi)（ 1～2 日齡） → 飼養(yǎng) → 觀察發(fā)病情況(未發(fā)病的鼠保留至21 天后作DFA檢測),3

26、1,4、ELISA——檢測狂犬病毒抗體ELISA方法測定的是總抗體，不代表具有保護性的中和抗體水平其結果僅供參考。5、染色鏡檢——檢測內(nèi)基氏小體,32,（四）狂犬病診斷標準（WS281-2008）中的檢測方法,1、DFA法——檢測狂犬病毒抗原 意義： 陽性結果，表明有狂犬病毒感染，有確診意義。2、ELISA——檢測狂犬病毒抗原 意義： 檢測到狂犬病毒抗原陽

27、性有診斷意義。3、細胞培養(yǎng)方法——分離狂犬病毒 意義： 陽性結果表明有狂犬病毒感染，有確診意義。,33,4、RT-PCR——檢測狂犬病毒核酸,原理： 狂犬病毒為負鏈RNA病毒，PCR前需要經(jīng)過逆轉錄酶作用，合成一條cDNA鏈（RT）,再進行PCR。檢測步驟： 1）病毒RNA的提取 2）逆轉錄合成cDNA

28、 3）PCR擴增 4）電泳意義： 陽性結果表明有狂犬病毒感染，有確診意義。,34,5、狂犬病特異性抗體檢測,狂犬病特異性抗體： 在自然感染情況下，狂犬病毒→通過帶有病毒的動物唾液→進入機體傷口→在入侵部位基本上不增殖（一般也不侵入血流） →故不能形成病毒血癥。 在感染后，狂犬病毒或其抗原→不能與機體免疫系統(tǒng)廣泛接觸→故機體無

29、免疫應答反應（針對狂犬病毒）。 晚期，狂犬病→破壞血腦屏障→ 大量病毒抗原→進入血流→刺激機體→產(chǎn)生大量特異性抗體。 因此，通常在發(fā)病早期血清中查不到抗體或抗體滴度很低，只在臨床疾病的晚期出現(xiàn)。,35,A. 快速熒光灶抑制試驗（RFFIT）—— 測定中和抗體意義： 中和抗體水平等于或高于0.5IU/ml 血清，表示能得到有效的保護B. ELISA—— 檢測狂犬病毒抗體意義：

30、 1）接種過狂犬病疫苗的患者抗體滴度大于0.5IU/ml ，表明已獲得一定的保護。 2）未接種過疫苗的患者的抗體滴度大于1IU/ml ，且近期有4倍增高，可考慮狂犬病。 3）部分狂犬病患者在臨死前抗體滴度也可能異常增高。,36,（五）美國 CDC 狂犬病實驗室操作手冊中的檢測方法,1、DFA ——檢測狂犬病毒抗原 當 以下情況發(fā)生時，需要重復（證實性）檢測: 1）包涵體顆粒典型，但視野不到 10％，或

31、視野大于 10％，但抗原分布極 度稀疏（如每個視野中只有 1 到 2 個包涵體顆粒）； 2）包涵體顆粒典型，但染色強度較弱且缺乏特征性； 3） 包涵體顆粒不典型，但染色強度好 （如結構大小均勻、形態(tài)規(guī)則）； 4） 非特異性熒光顆粒掩蓋了少量狂犬病毒顆粒的特異性染色； 5） 兩種試劑的檢測結果或兩個技術人員的結果判定不一致。當進行重復性確證性DFA

32、檢測時，通常采用兩種以上的檢測試劑進行同比實驗。,37,2、 RT-PCR——檢測核酸3、細胞培養(yǎng)法——分離病毒：鼠神經(jīng)瘤細胞（MNA） 目 的： 從未知的腦懸液中分離狂犬病毒， 作為 DFA 檢測之外的另一種確證性檢測結果解釋： ?分離到狂犬病毒，結果為陽性。 ?傳代 2 次后分離不到狂犬病毒，結果為陰性。 注 ：如果檢測