耐冷菌pseudomonassp.w7產(chǎn)低溫蛋白酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究

1、中文摘要中文摘要低溫蛋白酶在低溫條件下具有較高的催化活性，在食品、洗滌、化妝品、醫(yī)藥和環(huán)境生物治理中具有潛在的應(yīng)用價值。本論文對實驗室保存的耐冷菌P s e u d o m o n a s s p ．W 7 所產(chǎn)的低溫蛋白酶進(jìn)行分離純化，并系統(tǒng)的研究了該低溫蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)，為后期低溫蛋白酶的基因克隆和工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本研究是以實驗室保存的一株耐冷菌P s e u d o m o n a s s p ．W 7 為出發(fā)菌株，采用低溫?fù)u

2、床2 0 ℃培養(yǎng)4 8 h ，發(fā)酵液經(jīng)過1 2 0 0 0 r ／m m 離心后，經(jīng)硫酸銨分步沉淀、透析、S e p h a d e x G 1 0 0 凝膠過濾層析進(jìn)行分離純化，所得到的蛋白經(jīng)過電泳分析，其分子量約為5 0 k D a 。經(jīng)過純化后的蛋白酶比活力由1 5 1 ．1 6 U ／m g 提高到7 3 8 6 ．1 7 U ／m g ，純化倍數(shù)為4 8 ．8 6 倍，回收率達(dá)到1 1 ．4 0 ％。在獲得純化酶基礎(chǔ)上，對低溫

3、蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。該酶最適反應(yīng)溫度為3 7 。C ，在2 0 ．3 5 。C 范圍內(nèi)熱穩(wěn)定性較好，保持了8 0 ％以上的酶活性，當(dāng)溫度升高到5 5 “ C ，熱處理6 0 m i n 后，酶活力完全喪失；最適p H 值為7 ．2 ，屬于中性蛋白酶，在p H 4 ．1 0 范圍內(nèi)都具有較強(qiáng)的催化活性。金屬離子對酶活性有一定的影響，M n 2 + 表現(xiàn)出顯著的激活作用，而A 礦、H 9 2 + S ：I ] F e 3 + 的抑制

4、作用最強(qiáng)，抑制劑E D T A幾乎使酶失去活性，根據(jù)以上特點初步判斷該酶是金屬蛋白酶。有機(jī)溶劑對蛋白酶活性的影響小，在低濃度( 1 ％) 時只有丙三醇對蛋白酶活性表現(xiàn)出激活作用，當(dāng)高濃度( 1 0 ％) 時異丙醇和異丁醇表現(xiàn)出一定的抑制作用；保護(hù)劑對純化酶穩(wěn)定性的保護(hù)作用各不相同，海藻酸鈉適合對酶液進(jìn)行長期保護(hù)，而鈣離子適合對蛋白酶的短期保護(hù)作用。酶催化水解酪蛋白、牛血紅蛋白、牛血清蛋白三種底物，測定K m 值分別為0 ．2 3 6 9

5、 9 ／L 和0 ．4 1 8 4g ／L ，純化酶對牛血清白蛋白沒有水解作用，所以酪蛋白是其最適底物；改變反應(yīng)溫度，K m 略微呈現(xiàn)上升的趨勢，隨著溫度的升高，K 咖也逐漸上升，但K e a t ／K m 在I O 。C 、2 0 “ C 、3 0 * C 、4 0 6 C 幾乎一致，符合低溫蛋白酶的特征。本實驗還對低溫蛋白酶水解牛奶的能力進(jìn)行了分析，結(jié)果表明3 7 。C 下純化酶對牛A b s t r a c tA b s t r

6、a c tT h ec o l d - a d a p t e dp r o t e a s eh a sb e e nw i d e l ys t u d i e df o ri t s h i g ha c t i v i t yi nl o w e rt e m p e r a t u r e a s w e l l a s p o t e n t i a l h i 【g h v a l u e s f o r a p p l

7、i c a t i o n o n f o o d ，d e t e r g e n c e ，c o s m e t i c s , m e d i c i n e a n d e n v k o n m e n t b i o t e c h n o l o g y g o v e m a n c e ．T h e r e f o r e ，t h ec o l d - a d a p t e dp r o t e a s eh a

8、 sa r o u s e di n t e r e s t e db y s c i e n t i s t s a r o u n dt h e w o r l d ．I n t h i sp a p e r , t h ec o l d —a d a p t e d p r o t e a s ew h i c hi sp r o d u c e db y t h ep s y c h r o t r o p h sP s e u

9、 d o m o n a ss p ．W 7 p r e s e r v e di nt h el a b o r a t o r yh a sb e e ne x t r a c t e da n d p u r i f i e d ，a n dt h e ns t u d i e d t h ec h a r a c t e r i z a t i o n so f p u r i f i e d e n z y m es y s

10、t e m a t i c a l l y ．I tw i l lb eaf o u n d a t i o nf o r t h es t u d yo f i t sg e n ed o n e a n d f u r t h e r i n d u s t r i a la p p l i c a t i o n ．T h e s t r a i no f p s y c h r o t r o p h s P s e u d o

11、 m o n a s s p ．W 7 w a s c u l t u r e da t2 0 “ Cf o r4 8 h ，a n dt h e nt h ep r o t e a s ew a se x t r a c t e db yu l t r a f i l t r a t i o n ，a m m o n i u ms u l f a t ef r a c f i o n a t i o na n dd i a l y s

12、 i s ，S e p h a d e xG 1 0 0g e l f i l t r a t i o nW a sn e x tc a r r i e do u t f o rp r o t e a s ep u r i f i c a t i o n ．S D S - P A G E a n a l y s i sr e v e a l e da p r o t e i nb a n do f a r o u n d5 0 ．0k

13、D a ．T h es p e c i f i ca c t i v i t yr e a c h e d7 3 8 6 ．1 9U ／m ga n dw h i c hw a s4 8 ．8 6 f o l d sh i g h e rt h a nt h e c r u d ef e r m e n t i n gl i q u o ra n d t h ey i e l dw a s u p t o11 ．4 0 ％．T h ec

14、 h a r a c t e r i z a t i o n so f p u r i f i e dc o l d - a d a p t e dp r o t e a s eW a sc o n s e q u e n t l ys t u d i e d ．T h eo p t i m a lt e m p e r a t u r eo f t h e c o l d —a d a p t e dp r o t e a s ew

15、a s3 7 。C ，T h ee n z y m ea c t i v i t yr e m a i n e da tl e a s t8 0 ％，w h e np l a c e da tt h et e m p e r a t u r ef r o m2 0 。C t o3 5 “ Cf o rl h ，t h ee n z y m ew a st h e r m a l l a b i l i t y , t h e a c t

16、 i v i t y l o s t a f t e r i n c u b a t e d6 0 m i n a t 5 5 。C ．T h eo p t i m a lp H o f t h ep r o t e a s ew a s 7 ．2 ，i tW a s s t a b l e a tr a n g e f r o mp H 4 t o1 0 ．T h ep r o t e a s ea c t i v i t yw a

17、ss t i m u l a t e d b y №1 2 + a n di n h i b i t e db yA g + ，H 9 2 + a n d F e 3 十，C o m b i n e dw i t ht h e i n h i b i t o r E D T A ，i th a s a l m o s tl o s t t h ep r o t e a s e a c t i v i t y ．I t m a yb e

18、b e l o n g st om e t a l l o p r o t e i n a s e ．O r g a n i c s o l v e n t sh a v e a l i t t l ei n f l u e n c eo n p r o t e a s ea c t i v i t y ．P r o t e a s ea c t i v i t yw a ss t i m u l a t e db yg l y c e

19、 r o l ，W h e nt h e f i n a l c o n c e n t r a t i o nc a m et o 10 ％，t h ep r o r e a s ew a si n h i b i t e db yi s o p r o p a n o la n di s o b u t a n 0 1 ．T h e i n h i b i t o r yr a t er e a c h e dt o8 0 ．7 1

20、 ％a n d 6 3 ．1 2 ％．A m o n gt h ep r o t e c t i v ea g e n t ，s o d i u ma l g i n a t ew a s s u i t a b l ef o rt h el o n g —t e r mp r o t e c t i o n ．C —d i dS Of o r s h o r t ·t e r m ．T h e p r o t e a s e

21、c a t a l y z e dt h eh y d r o l y s i so f c a s e i n ，b o v i n eh a e m o g l o b i na n d b o v i n es e r u m a l b u m i n ，W i t h aK mo f 0 ．2 3 6 9 g ／L f o r c a s e i n ，0 ．4 1 8 4 g ／L f o r b o v i n e．1 1