代謝工程改造類球紅細菌促進輔酶Q10合成的研究.pdf

1、輔酶Q10廣泛存在于生物細胞內(nèi)，是呼吸鏈中的電子傳遞體，其結構由醌環(huán)和聚異戊二烯側鏈組成。輔酶Q10具有增強呼吸鏈，加大能量供給的作用，被廣泛應用于各種疾病的治療和預防，如:心臟病、高血壓和帕金森等。除此之外，由于輔酶Q10還具有良好的抗氧化能力，所以在食品和化妝品市場的需求量也與日俱增。本文對影響類球紅細菌合成輔酶Q10的相關因素進行分析，并在此基礎上對其生物合成途徑進行綜合代謝調(diào)控以構建輔酶Q10高產(chǎn)菌株。
　　目前關于輔酶Q

2、10工程菌的構建思路主要集中于對其生物合成途徑基因的過表達。雖然這些調(diào)控策略取得了很好的效果，但在代謝網(wǎng)絡中還有很多其他途徑會對輔酶Q10的積累產(chǎn)生影響。如，能夠和輔酶Q10競爭前體物醌環(huán)和萜類物質(zhì)的代謝途徑;與呼吸鏈功能相關的代謝途徑等等。在本研究中，主要對這些非輔酶Q10合成途徑進行調(diào)控，然后將其與輔酶Q10合成途徑相結合進行綜合調(diào)控。
　　在類球紅細菌中，類胡蘿卜素缺失會對細胞生長造成非常不利的影響。但是類胡蘿卜素又與輔酶Q

3、10合成途徑競爭前體物質(zhì)香葉基香葉基焦磷酸(GGPP)。為了減少類胡蘿卜素途徑對GGPP的競爭，同時維持類球紅細菌細胞的正常生長，本研究通過過表達光氧調(diào)控因子ppsR抑制crt系列基因的表達強度，使類胡蘿卜素的合成受到適度抑制，從而使輔酶Q10的產(chǎn)量提高了28％左右。由于PpsR對光合基因具有普遍的抑制作用，GGPP合成關鍵酶crtE的表達強度也被抑制到只有野生型的一半。本研究將crtE和ppsR串聯(lián)用tac啟動子表達，從而解除了Pps

4、R對crtE表達的抑制，達到了進一步提高輔酶Q10產(chǎn)量的目的。最終輔酶Q10的產(chǎn)量達到73.2 mg/L，比野生型提高了47％。
　　作為細胞呼吸鏈的遞氫體，輔酶Q10的主要功能是將NADH上的電子轉移到呼吸鏈。所以輔酶Q10的功能與胞內(nèi)NADH/NAD+比例有著緊密的聯(lián)系。在本研究中，通過過表達gapA-1使RspgapA中NADH/NAD+比例較對照組提高了2倍，同時輔酶Q10的產(chǎn)量也提高了29％。這一現(xiàn)象證明了類球紅細菌胞內(nèi)

5、的NADH/NAD+比值與輔酶Q10的積累存在著正相關的關系。但是在這一過程中RspgapA的生物量卻下降了。為了提高類球紅細菌的生物量，本研究在類球紅細菌中表達了外源的vgb基因來提高菌體的攝氧率，通過協(xié)同調(diào)控氧化還原電位和攝氧率來進一步提高輔酶Q10的產(chǎn)量。最終RspGV的輔酶Q10產(chǎn)量達到了83.24mg/L，與野生型相比提高了71％。對gapA-1的兩個同工酶gapB2和gapB3分別進行過表達也提高了NADH/NAD+比例，同

6、時增強了類球紅細菌輔酶Q10的合成能力。該現(xiàn)象進一步確認了加強甘油醛-3-磷酸脫氫酶的表達可以提高NADH/NAD+比例，進而提高輔酶Q10的產(chǎn)量。
　　結合上述兩種調(diào)控策略，對類胡蘿卜素合成途徑和氧化還原電勢及攝氧率進行協(xié)同調(diào)控，構建了RspPEGV菌株。該菌株的類胡蘿卜素合成途徑被顯著地抑制，但是由于生物量出現(xiàn)大幅的下滑，導致最終的輔酶Q10產(chǎn)量只有62.71 mg/L，低于單獨調(diào)控時的產(chǎn)量。
　　由于兩個非輔酶Q10合

7、成途徑結合調(diào)控的效果不理想，所以將上述兩個非輔酶Q10合成途徑分別結合輔酶Q10合成途徑進行綜合調(diào)控。首先協(xié)同調(diào)控類胡蘿卜素合成途徑和輔酶Q10合成途徑，構建RspMQPE菌株。該菌株的類胡蘿卜素合成途徑同樣受到顯著的抑制。雖然輔酶Q10的產(chǎn)率高于單獨調(diào)控類胡蘿卜素的策略，但是仍然低于RspMQd菌株（綜合調(diào)整MEP途徑和醌環(huán)修飾途徑的類球紅細菌，本實驗室構建），最終的輔酶Q10產(chǎn)量并沒有得到提高。然后協(xié)同調(diào)控氧化還原電勢及攝氧率和輔酶

8、Q10合成途徑，構建了RspMQGV菌株。RspMQGV的生物量和NADH/NAD+比例與RspMQd相比都得到了提高。最終RspMQGV的輔酶Q10產(chǎn)量比RspMQd提高了19％，與野生型相比提高了2.36倍。
　　本研究還考察了供氧條件對輔酶Q10合成的影響，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵前期充分供氧，發(fā)酵中后期適當限制氧供給有利于輔酶Q10的積累。最后通過高密度發(fā)酵實驗進一步考察RspMQGV菌株的輔酶Q10生產(chǎn)水平。經(jīng)過96h的發(fā)酵，輔酶Q1