鐮孢紅素酮對(duì)腎臟細(xì)胞的毒性機(jī)制及輔酶Q10對(duì)其保護(hù)效應(yīng)的研究.pdf

1、鐮孢紅素酮(Fusarochromanone，F(xiàn)C101)，是由鐮刀茵屬木賊鐮刀菌(Fusariumequiseti)產(chǎn)生的一種真菌毒素，廣泛存在于動(dòng)物飼料、糧食及農(nóng)作物中。畜禽持續(xù)攝入被FC101污染的食物及飼料后，可能會(huì)出現(xiàn)急性癥狀，也可能導(dǎo)致嚴(yán)重的慢性病變，最終引發(fā)癌癥，從而給畜禽業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。盡管有一些研究對(duì)FC101危害人類(lèi)及動(dòng)物健康的毒性機(jī)制進(jìn)行探索，但是FC101毒素的毒性機(jī)理尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn)FC101可能通過(guò)

2、阻滯細(xì)胞于G1期，抑制細(xì)胞增殖，引起腎臟細(xì)胞COS7，HEK293的毒性作用，并且可能通過(guò)caspase依賴(lài)和非依賴(lài)兩種方式引起腎臟細(xì)胞死亡。通過(guò)進(jìn)一步探討FC101引起細(xì)胞死亡的分子機(jī)制，我們發(fā)現(xiàn)FC101可誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，ROS發(fā)揮促進(jìn)凋亡和自噬的作用。此外FC101誘導(dǎo)氧化應(yīng)激產(chǎn)生細(xì)胞毒性可能涉及到了ROS介導(dǎo)的FC101下調(diào)PP2A，PP5蛋白表達(dá)水平，從而導(dǎo)致JNK通路激活。輔酶Q10(CoQ10)是呼吸鏈的重要成員之一，它與

3、線(xiàn)粒體內(nèi)膜相結(jié)合，參與細(xì)胞氧化磷酸化及ATP生成過(guò)程，是細(xì)胞自身的天然抗氧化劑，細(xì)胞代謝的激活劑。目前臨床上CoQ10主要應(yīng)用于急、慢性充血性心力衰竭，病毒性肝炎和癌癥的輔助治療。CoQ10在ROS造成的損傷下可保護(hù)并增強(qiáng)細(xì)胞功能。但是關(guān)于CoQ10在FC101誘導(dǎo)腎臟細(xì)胞死亡中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)將探究FC101對(duì)腎臟細(xì)胞的毒性機(jī)制及CoQ10對(duì)其的保護(hù)效應(yīng)。試驗(yàn)分為以下四個(gè)部分:
　　1.FC101對(duì)腎臟細(xì)胞周期分布的影響

4、及其機(jī)制探討FC101對(duì)腎臟細(xì)胞COS7，HEK293的毒性效應(yīng)。以COS7，HEK293細(xì)胞為細(xì)胞模型，F(xiàn)C101(0～5μM)單獨(dú)處理細(xì)胞6天或者24～72h，在倒置相差顯微鏡下分析細(xì)胞形態(tài)，one-solution實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞存活率，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，Western Blot實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞周期蛋白變化。我們發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞經(jīng)不同濃度的FC101(0～5μM)處理6天后，細(xì)胞細(xì)胞密度及個(gè)數(shù)明顯減少，細(xì)胞增殖減慢，細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，表

5、現(xiàn)為貼壁細(xì)胞變圓、皺縮、脫落、細(xì)胞體積變小。FC101以濃度依賴(lài)方式抑制腎臟細(xì)胞COS7，HEK293增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。此外，當(dāng)細(xì)胞暴露于FC101時(shí)間為24～72小時(shí)后，one-solution檢測(cè)法結(jié)果顯示FC101降低細(xì)胞活性。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，細(xì)胞經(jīng)FC101處理24小時(shí)后，細(xì)胞停滯在G0/G1期的比例從33.2％上升到57.4％，F(xiàn)C101呈劑量依賴(lài)性阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期。此外，用1μM濃度的FC101分別處理細(xì)胞2

6、4小時(shí)，48小時(shí)，72小時(shí)后，F(xiàn)C101呈時(shí)間依賴(lài)性阻滯細(xì)胞于G0/G1期。同時(shí)，F(xiàn)C101呈劑量依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性下調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1，細(xì)胞周期依賴(lài)性激酶(CDK4和CDK6)，細(xì)胞周期調(diào)控因子Cdc25A的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)細(xì)胞周期素依賴(lài)性激酶抑制因子(p21 Cip1，p27Kip1)的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致Rb去磷酸化。結(jié)果表明，F(xiàn)C101通過(guò)下調(diào)細(xì)胞周期調(diào)控因子CyclinD1、CDK4、CDK6、Cdc25A、p-Rb，

7、上調(diào)細(xì)胞周期素依賴(lài)性激酶抑制因子p21Cip1，p27 Kip1的表達(dá)進(jìn)而阻滯細(xì)胞于G0/G1期，從而抑制細(xì)胞增殖，引起細(xì)胞毒性作用。
　　2.FC101對(duì)腎臟細(xì)胞凋亡和自噬的影響探究FC101如何誘導(dǎo)細(xì)胞死亡以及FC101誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的分子機(jī)制。以COS7，HEK293細(xì)胞為細(xì)胞模型，F(xiàn)C101(0～5μM)單獨(dú)處理細(xì)胞或者使用泛caspase抑制劑(Z-VAD-FMK)、自噬抑制劑(CQ)、ROS清除劑(NAC)預(yù)處理細(xì)胞后聯(lián)

8、用FC101(0～5μM)處理0～72小時(shí);采用腺病毒Ad-GFP-LC3感染COS7細(xì)胞24小時(shí)后，再用FC101處理24小時(shí)。Trypan blue拒染法檢測(cè)細(xì)胞死亡率、AnnexinⅤ-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)和DAPI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡、免疫熒光染色法檢測(cè)自噬、CM-H2DCFDA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的生成、Caspase-3/7 Assay試劑盒檢測(cè)Caspase-3/7活性，Western Blot分析BAD、BAX

9、、BAK、Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、survivin、DR5、cleaved caspase3、cleaved caspase8、cleaved PARP、AIF、LC3A/B、H2A、γ-H2AX(ser139)、p53、ATM、phospho-ATM(ser1981)、ATR、phospho-ATR(ser428)、NFκB(p65)，phospho-NFκB(p65)(Ser139)蛋白表達(dá)及活性表現(xiàn)。我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)C1

10、01呈劑量依賴(lài)和時(shí)間依賴(lài)方式引起細(xì)胞死亡。同時(shí)FC101呈濃度依賴(lài)方式上調(diào)促凋亡蛋白BAD及外部死亡受體通路蛋白DR5的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-2、Bcl-xL、survivin表達(dá)，提高cleaved caspase8蛋白表達(dá)量及活化caspase3，并以濃度依賴(lài)方式造成PARP裂解。但是并未顯著引起促凋亡基因BAK和BAX的表達(dá)變化。此外，細(xì)胞經(jīng)FC101處理后，激光共聚焦熒光顯微鏡觀(guān)察下發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞核經(jīng)DAPI染色后

11、出現(xiàn)核皺縮，核碎裂，染色質(zhì)聚集等凋亡特征，我們還發(fā)現(xiàn)FC101誘導(dǎo)凋亡誘導(dǎo)因子AIF發(fā)生核移位，AIF由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核。并且FC101誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬，表現(xiàn)為自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ顆粒聚集程度增加，LC3Ⅱ蛋白表達(dá)量提高，使用自噬抑制劑氯喹(CQ)處理細(xì)胞后，通過(guò)one-solution實(shí)驗(yàn)分析可知自噬抑制劑CQ顯著提高細(xì)胞存活率，減輕FC101對(duì)細(xì)胞的毒性作用。另外，使用特異性熒光探針CM-H2DCFDA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的生成發(fā)現(xiàn)FC

12、101引起細(xì)胞內(nèi)ROS水平呈濃度依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性升高。激光共聚焦熒光觀(guān)測(cè)結(jié)果顯示ROS清除劑NAC可使細(xì)胞核碎裂減少，保持胞核完整性，減少凋亡細(xì)胞數(shù)量。NAC顯著降低胞質(zhì)內(nèi)LC3Ⅱ顆粒聚集程度。同樣NAC降低促凋亡蛋白BAD，cleavedcaspase3的蛋白表達(dá)量，增加抗凋亡蛋白Bcl-xL的表達(dá)量。此外，F(xiàn)C101以濃度依賴(lài)方式激活NFκB、P53，并且引起DNA損傷蛋白H2AX和ATM磷酸化表達(dá)水平升高。結(jié)果表明，F(xiàn)C101誘

13、導(dǎo)COS7、HEK293細(xì)胞發(fā)生凋亡及自噬，引起細(xì)胞死亡，機(jī)制上可能涉及NFκB和p53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。并且FC101誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，ROS發(fā)揮促進(jìn)凋亡和自噬的作用。此外FC101可能造成DNA損傷。
　　3.氧化應(yīng)激和JNK信號(hào)通路介導(dǎo)的FC101誘導(dǎo)腎臟細(xì)胞毒性機(jī)制研究探討FC101致腎臟細(xì)胞COS7，HEK293死亡的毒性機(jī)制及涉及到的相關(guān)信號(hào)通路。COS7和HEK293細(xì)胞為細(xì)胞模型，F(xiàn)C101(0～5μM)單獨(dú)處理或使用ROS

14、清除劑(NAC)，JNK抑制劑SP600125預(yù)處理細(xì)胞1小時(shí)后聯(lián)用FC101(0～5μM)處理24小時(shí);采用腺病毒干擾，過(guò)表達(dá)c-Jun、PP2A、PP5后，經(jīng)FC101(0.5，1μM)處理24小時(shí)。CM-H2DCFDA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)生成，倒置相差顯微鏡下分析細(xì)胞形態(tài)，one-solution實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞存活率，Western Blot分析MAPK信號(hào)通路中MAPK(Erk1/2、JNK、p38)和蛋白磷酸酶(PP2A，

15、PP5)的表達(dá)水平。我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)C101誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，激活JNK信號(hào)通路，使用JNK抑制劑(SP600125)或者使用腺病毒過(guò)表達(dá)c-Jun后可削弱FC101對(duì)細(xì)胞的毒性。N-乙酰-L半胱氨酸(NAC)預(yù)處理后可明顯清除FC101誘導(dǎo)下的ROS產(chǎn)生。此外，ROS抑制JNK通路激活，減輕細(xì)胞毒性。FC101引起ROS水平升高，降低絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶2A(PP2A)和絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶5(PP5)的表達(dá)量，NAC則阻止FC10

16、1下調(diào)蛋白磷酸酶PP2A,PP5的表達(dá)量。此外，過(guò)表達(dá)PP2A，PP5可抑制JNK磷酸化以及減輕細(xì)胞毒性。結(jié)果表明，F(xiàn)C101通過(guò)誘導(dǎo)ROS，下調(diào)蛋白磷酸酶PP2A，PP5的表達(dá)，進(jìn)而激活JNK通路引起腎臟細(xì)胞毒性作用。
　　4.C0Q10通過(guò)抑制氧化應(yīng)激及JNK通路保護(hù)FC101誘導(dǎo)COS7細(xì)胞毒性探討CoQ10對(duì)于FC101損傷細(xì)胞后的保護(hù)作用及其保護(hù)機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)以COS7細(xì)胞作為細(xì)胞模型，使用FC101(0～5μM)單獨(dú)處理

17、或者使用CoQ10，或JNK抑制劑SP600125預(yù)處理細(xì)胞1小時(shí)或30分鐘后，聯(lián)用FC101(0～5μM)處理6天或24小時(shí);采用腺病毒干擾，過(guò)表達(dá)c-Jun后，細(xì)胞經(jīng)CoQ10預(yù)處理1小時(shí)，再用FC101(1μM)處理24小時(shí)。CM-H2DCFDA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的生成，倒置相差顯微鏡下分析細(xì)胞形態(tài)，one-solution實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞活性，Western Blot分析c-Jun、Bad、Bcl-xL和cleaved-ca

18、spase3的表達(dá)水平。我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)C101通過(guò)誘導(dǎo)ROS引起細(xì)胞凋亡，CoQ10可通過(guò)阻止ROS產(chǎn)生，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。CoQ10可顯著削弱FC101誘導(dǎo)下的細(xì)胞活性降低，并且CoQ10恢復(fù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)，抑制細(xì)胞核皺縮及碎裂。CoQ10可減少Bad的表達(dá)水平、提高Bcl-xL的的表達(dá)水平、降低caspase-3的活性。此外，CoQ10抑制JNK通路激活。使用JNK抑制劑(SP600125)或腺病毒過(guò)表達(dá)c-Jun則增強(qiáng)CoQ10削弱FC