乳酸的來源和生成途徑研究及13C對13C標記化合物質(zhì)譜行為的影響.pdf

1、背景:
　　乳酸對于腫瘤細胞的生存和腫瘤診治意義重大，是腫瘤代謝領(lǐng)域的研究熱點之一，有報道指出乳酸根離子和氫離子共同作用可以幫助腫瘤細胞在葡萄糖缺乏的環(huán)境中生存。應(yīng)用這一原理，對肝細胞癌患者施行肝動脈化療栓塞，將碳酸氫鈉局部灌注到腫瘤中，療效良好，顯著提高了患者生存期。許多研究關(guān)注乳酸對腫瘤細胞的作用以及在不同條件下乳酸的生成量。目前認為乳酸可以由葡萄糖或谷氨酰胺生成，但兩種來源的比例還不清楚。另外，葡萄糖可以經(jīng)糖酵解直接生成乳酸

2、，也可以經(jīng)磷酸戊糖途徑后回到糖酵解生成乳酸，但這兩種路徑生成的乳酸各占乳酸總量的百分之多少還不清楚。本文的初衷是采用基于LC-MS/MS檢測的13C標記追蹤法研究乳酸的來源分布和生成途徑分布情況，卻意外發(fā)現(xiàn)13C會影響13C標記乳酸的質(zhì)譜行為，到現(xiàn)在為止這一現(xiàn)象還未見報道，而基于質(zhì)譜檢測的13C追蹤法在代謝研究領(lǐng)域應(yīng)用得非常廣泛，因此這一發(fā)現(xiàn)具有較大的理論意義，且對基于質(zhì)譜檢測的13C追蹤法的應(yīng)用也具有指導(dǎo)作用。
　　方法:

3、>　　為了探索細胞內(nèi)乳酸的來源分布和生成途徑分布情況，本文分別用[U-13C]-、[1，2-13C2]-、[3-13C]-、[1-13C]-、[1，2，3-13C3]-、[4-13C]-和[6-13C]葡萄糖孵育細胞，用LC-MS/MS檢測培養(yǎng)液中的乳酸和各類13C標記乳酸。因意外發(fā)現(xiàn)13C可能會影響13C標記乳酸的質(zhì)譜行為，故用LC-MS和LC-MS/MS檢測以下標準品:乳酸、[1-13C]乳酸、[3-13C]乳酸、[2，3-13C2

4、]乳酸和[U-13C]乳酸，并用DFT法計算乳酸和各類13C標記乳酸碎裂途徑中間產(chǎn)物的活化能。另外，為了單純研究葡萄糖經(jīng)糖酵解生成的乳酸，本文在體外建立無細胞糖酵解反應(yīng)體系，分別以[1-13C]-、[3-13C]-、[4-13C]-、[6-13C]-、[1，2-13C2]-和[1，2，3-13C3]葡萄糖為底物，用LC-MS/MS檢測生成的乳酸和各類13C標記乳酸。最后，為了探索13C對13C標記化合物質(zhì)譜行為的影響是否具有普遍性，本文

5、用LC-MS和LC-MS/MS檢測以下標準品:葡萄糖、[U-13C]葡萄糖、谷氨酰胺和[U-13C]谷氨酰胺。
　　結(jié)果:
　　1.用基于LC-MS/MS的13C追蹤法測定乳酸和各類13C標記乳酸的百分比，并計算乳酸的來源分布和生成途徑分布情況
　　1)用[U-13C]葡萄糖孵育細胞，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞中由葡萄糖、其他來源以及混合來源生成的乳酸分別占97％、2％、1％。正常T細胞中結(jié)果略有差異，以上三種來源生成的乳酸分別占:

6、90％、8％和2％。
　　2)用[1，2-13C2]葡萄糖孵育細胞，發(fā)現(xiàn)在腫瘤細胞中經(jīng)糖酵解生成的乳酸占90％、經(jīng)磷酸戊糖途徑后返回糖酵解生成的乳酸占6.6％、經(jīng)其他途徑生成的乳酸占2.2％。正常T細胞中結(jié)果略有差異:經(jīng)以上三種途徑生成的乳酸分別占85％、6.0％和7.9％。
　　3)用[3-13C]葡萄糖孵育細胞，發(fā)現(xiàn)在腫瘤細胞中經(jīng)糖酵解生成的乳酸占89％、經(jīng)磷酸戊糖途徑后返回糖酵解生成的乳酸占9.2％、經(jīng)其他途徑生成的乳

7、酸占2.2％。正常T細胞中結(jié)果略有差異:經(jīng)以上三種途徑生成的乳酸分別占84％、8.1％和7.9％。
　　4)葡萄糖經(jīng)糖酵解，1，2，3位碳原子生成的乳酸與4，5，6位碳原子生成的乳酸應(yīng)當?shù)攘?，[3-13C]葡萄糖組的結(jié)果符合理論，但[1，2-13C2]葡萄糖組的結(jié)果不符合。為進一步探索葡萄糖1，2，3位碳原子和4，5，6位碳原子經(jīng)糖酵解生成的乳酸是否等量，分別用[1-13C]-、[6-13C]-、[1，2，3-13C3]-和[4-

8、13C]標記葡萄糖孵育細胞，結(jié)果顯示，經(jīng)糖酵解由葡萄糖1，2，3位碳原子生成的乳酸與4，5，6位碳原子生成的乳酸的比值不一致，最小為0.85（[6-13C]葡萄糖），最大為1.6（[1，2，3-13C3]葡萄糖）。
　　2.證實13C影響13C標記乳酸的質(zhì)譜行為，并提出基于質(zhì)譜檢測的13C追蹤實驗結(jié)果需要校正。
　　乳酸標準品分別與各類13C標記乳酸標準品([2,3-13C2]-、[3-13C]-、[U-13C]-和[1-1

9、3C]乳酸)混合，并分別用LC-MS和LC-MS/MS檢測各混合液，發(fā)現(xiàn)13C顯著影響13C標記乳酸的碎裂效率，而對離子化效率影響不大。將前文13C標記葡萄糖([U-13C]-、[1，2-13C2]-、[3-13C]-、[1-13C]-、[6-13C]-、[1，2，3-13C3]-和[4-13C]葡萄糖)孵育細胞的結(jié)果進行校正，并重新計算乳酸的來源分布和生成途徑分布。校正后，所有結(jié)果均符合理論。
　　3.計算乳酸碎裂過程中間產(chǎn)物的

10、活化能，并與實驗結(jié)果對比，提出一個理論悖論經(jīng)理論計算，乳酸碎裂過程中過渡態(tài)2（丟CO）是乳酸碎裂的限速步驟。乳酸過渡態(tài)2的活化能小于或等于各類13C標記乳酸，由此推論乳酸丟CO的效率等于或大于各類13C標記乳酸，這與前文標準品實驗結(jié)果相反，故由此得出一個悖論。
　　4.體外無細胞糖酵解系統(tǒng)中，13C標記葡萄糖經(jīng)糖酵解1，2，3位碳原子與4，5，6位碳原子生成的乳酸不等，且二者比值與葡萄糖地13C標記位置有關(guān)。
　　分別用[1

11、，2-13C2]-、[1，2，3-13C3]-、[1-13C]-、[3-13C]-、[4-13C]-和[6-13C]葡萄糖作為體外無細胞糖酵解系統(tǒng)的底物，用LC-MS/MS檢測生成的乳酸和13C標記乳酸，校正后，結(jié)果顯示若底物的13C標記在1，2，3位碳原子([1，2-13C2]-、[1，2，3-13C3]-、[1-13C]-、[3-13C]葡萄糖），由葡萄糖1，2，3位碳原子生成的乳酸與4，5，6位碳原子生成的乳酸的比值是0.64;若

12、底物的13C標記在4，5，6位碳原子([4-13C]-、[6-13C]葡萄糖)，葡萄糖1，2，3位碳原子生成的乳酸與4，5，6位碳原子生成的乳酸的比值是0.8，理論上不論13C標記在什么位置，二者比例都應(yīng)當是1，但實驗結(jié)果與理論不符，且具有規(guī)律性，其原因還未明確，需要設(shè)計其他實驗進一步研究。
　　5.13C標記影響葡萄糖和谷氨酰胺的質(zhì)譜行為
　　用LC-MS和LC-MS/MS分別檢測葡萄糖標準品和[U-13C]葡萄糖標準品的

13、等濃度混合液以及谷氨酰胺標準品和[U-13C]谷氨酰胺標準品的等濃度混合液，發(fā)現(xiàn)13C對[U-13C]葡萄糖和[U-13C]谷氨酰胺的碎裂效率均有影響，可見13C對13C標記化合物質(zhì)譜行為的影響具有普遍影響。
　　結(jié)論:
　　1)本文首次系統(tǒng)地闡明腫瘤細胞4T1、Hela、 K562和小鼠胸腺細胞乳酸的來源分布和生成途徑分布。
　　2)本文首次發(fā)現(xiàn)13C顯著影響了13C標記乳酸在質(zhì)譜中的離子化過程和碎裂效率，并發(fā)現(xiàn)13