基于色譜分離和13C NMR模式識別聯(lián)用技術(shù)在八角蓮活性成分分離鑒定中的應(yīng)用.pdf

1、天然產(chǎn)物是新藥研發(fā)的一個重要源泉。我國是中藥資源豐富的國家，但這些寶貴的中藥資源其成分十分復(fù)雜，如何快速有效地識別和分離純化這些資源中的活性成分是當(dāng)前天然產(chǎn)物研究中的重要問題。因此，本論文選取了我國傳統(tǒng)中藥八角蓮作為研究對象，建立了幾種有效分離和識別其活性成分的方法，為開發(fā)中藥資源奠定了一定的科學(xué)基礎(chǔ)。
　　論文首先建立了一種基于反相液相色譜分離-13C NMR模式識別的研究策略，能夠從八角蓮代謝產(chǎn)物中快速識別已知的成分，進行去重

2、復(fù)化操作;同時能夠迅速地尋找出可能未知的成分進行靶向地分離純化。整個過程只需要簡單的液相分離(reversed-phase liqiudchromatography, RPLC)和進一步的NMR圖譜分析便能完成。最終利用13C NMR在線數(shù)據(jù)庫和文獻數(shù)據(jù)檢索從聚類的13C NMR二維圖譜數(shù)據(jù)中快速地識別出7種已知的化合物，包括5種鬼臼毒素類化合物和2種黃酮類化合物。另外根據(jù)HPLC及13C NMR二維圖譜數(shù)據(jù)信息，鑒別出6種新的雙黃酮類

3、成分和另外2種己知成分，并對其結(jié)構(gòu)進行了鑒定分析。這是首次基于RPLC分段方法和離線的13C NMR為基礎(chǔ)的模式識別方法對天然代謝產(chǎn)物中己知和未知成分進行快速鑒定識別和靶向分離純化的實例，它包含了非靶向的不完全分離和靶向的定向分離兩個過程。這種方法的建立對于天然代謝產(chǎn)物的去重復(fù)化和新成分的快速定位等都具有重要的意義。
　　其次為了有效地分離制備天然產(chǎn)物中的活性成分，采用了系統(tǒng)的液-液萃取-13C NMR模式識別，并結(jié)合新型錐度逆流

4、色譜分離的方法，對八角蓮中的活性成分進行了有效的制備分離。首先利用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(hexane-ethyl acetate-methanol-water, HEMWat)四元溶劑體系系統(tǒng)地對八角蓮根莖中的成分進行選擇性的萃取分離，并利用13C NMR技術(shù)對得到的萃取產(chǎn)物中的化學(xué)成分進行表征，最后針對不同的成分利用新型的錐度逆流色譜進行有效的制備分離。首先利用HEMWat(1∶9∶1∶9，v/v/v/v)體系對富含糖類和糖苷類

5、成分的HEMWat(2∶8∶2∶8，v/v/v/v)下相萃取產(chǎn)物進行了分離純化，得到了5種鬼臼毒素類和黃酮類化合物的糖苷。其次在對HEMWat(2∶8∶2∶8，v/v/v/v)上相萃取產(chǎn)物進行脫脂之后，利用HEMWat(4∶6∶4∶6，v/v/v/v)體系分離得了12種鬼臼毒素類及黃酮類化合物，質(zhì)量占70％以上的成分是鬼臼毒素類化合物，約占30％的成分是黃酮類化合物，其中包含2個已知的和1個新的雙黃酮類化合物。結(jié)果表明基于液-液分離-1

6、3C NMR模式識別并結(jié)合錐度逆流色譜分離的研究策略能夠有效地對天然產(chǎn)物進行有效的萃取和分離制備。
　　最后利用抗腫瘤活性跟蹤的方法，以人類肝癌細胞HepG2為篩選模型，利用逆流色譜技術(shù)，通過梯度洗脫的方式從八角蓮提取物中快速分離得到了四種活性最強的鬼臼毒素類化合物，分別是4'-去甲基鬼臼毒素，鬼臼毒素，α-足葉草素以及β-足葉草素。在實驗中，只需要一步的CCC分離便能得到3個純度都在95％的鬼臼毒素類化合物，另外一個化合物的純度