基于色譜聯(lián)用技術(shù)的沉香標(biāo)志性差異成分分析研究.pdf

1、目的:
　　沉香主要來(lái)源于瑞香科沉香屬（Aquilaria）和擬沉香屬（Gyrinops）含有樹脂的木材，主要分布于我國(guó)廣東，海南，廣西等地及印尼、越南、柬埔寨、馬來(lái)西亞等東南亞國(guó)家。沉香分為進(jìn)口沉香和國(guó)產(chǎn)沉香兩種，國(guó)產(chǎn)沉香基原植物為沉香屬Aquilaria sinensis，而進(jìn)口沉香基源植物多為沉香屬Aquilaria malaccensi、Aquilaria crassna。沉香品質(zhì)好壞跟種源、結(jié)香方式等密切相關(guān)，現(xiàn)代分子鑒

2、定技術(shù)雖然能夠鑒別出沉香基原，但對(duì)同一來(lái)源不同結(jié)香方式的樣品的區(qū)分尚未有有效方法。特定的種源和特定的結(jié)香方式會(huì)產(chǎn)生特定的化學(xué)成分，因此通過(guò)分析沉香內(nèi)在化學(xué)成分的差異可能是沉香種源鑒別、質(zhì)量控制、品質(zhì)分類的一條很好的途徑。目前尚未不清楚不同類型沉香間有存在哪些差異，也尚未建立篩選識(shí)別這些差異成分的方法，因此本文擬結(jié)合沉香內(nèi)在成分的特點(diǎn)，利用現(xiàn)代先進(jìn)分析儀器和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，采用GCMS和LCMS結(jié)合多元統(tǒng)統(tǒng)計(jì)和單維分析方法對(duì)沉香成分進(jìn)行全面系

3、統(tǒng)分析，輔以主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)等統(tǒng)計(jì)方法，找出不同沉香組間的差異成分，同時(shí)對(duì)不同類型的沉香成分進(jìn)行分類比較和聚類分析，為沉香快速鑒別、質(zhì)量控制和品質(zhì)分類提供參考和依據(jù)。
　　方法:
　　(1)按2015版中國(guó)藥典一部沉香鑒別項(xiàng)下相關(guān)要求測(cè)定樣品醇浸出物的含量，采用HPLC法(色譜柱Altima C18(150 mm×4.6 mm，5μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1％甲酸水(B)，

4、梯度洗脫，流速0.7 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)252 nm，柱溫30℃）測(cè)定樣品中的沉香四醇含量，結(jié)合醇浸出物和沉香四醇含量結(jié)果初步分析探討不同類型沉香間的差異。
　　(2)采用GCMS聯(lián)用儀(HP-5彈性石英毛細(xì)管柱(0.25 mm×30 m，0.25μm)，載氣為高純氦氣，流速為1.0 mL· min-1，不分流，進(jìn)樣量為5μl，進(jìn)樣口溫度250℃，傳輸線溫度280℃，起始溫度90℃，保持3 min，然后以10℃·min-1

5、升至180℃，然后以3℃·min-1升至280℃，保持10 min，然后以5℃·min-1升至300℃，保持8min。EI電離70 eV,離子源溫度為230℃，四級(jí)桿溫度150℃，掃描方式為全掃描，掃描范圍m/z為50-550)分析測(cè)定樣品中的化學(xué)成分，采用標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)NIST14和保留指數(shù)對(duì)沉香揮發(fā)油進(jìn)行定性鑒別，將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Simca-P軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，分析不同類型沉香間的差異，找出其差異標(biāo)志物，同時(shí)對(duì)沉香特征性成分進(jìn)行歸

6、納分類比較，分析內(nèi)在質(zhì)量差異的原因。
　　(3)采用LC-QTOFMS聯(lián)用儀(InetrSustainSwift C18色譜柱(2.1×150 mm，1.9μm);流速:0.3ml/min;柱溫:40℃;流動(dòng)相:乙腈(A):0.1％甲酸水溶液(B)梯度洗脫(0-3min,10％A;3-8min,10％-30％A;8-25min,30％-50％A;25-32min,50％-100％A，32-35min，100％A);進(jìn)樣量:10μL

7、; ESI離子源，正離子模式，一級(jí)質(zhì)譜(m/z100～2000，DP100，CE10，采集時(shí)間:0.2s)，二級(jí)質(zhì)譜(m/z50～2000，DP100，CE45，采集時(shí)間:0.01s)分析測(cè)定樣品中的化學(xué)成分，對(duì)采集數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理后導(dǎo)入Simca-P軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，分析不同類型沉香間的差異，找出其差異標(biāo)志物，同時(shí)對(duì)沉香特征性成分進(jìn)行歸納分類比較，分析內(nèi)在質(zhì)量差異的原因。
　　結(jié)果:
　　(1)52份沉香樣品中沉香四醇含

8、量為0.10-6.60％，醇浸出物含量為6.07-57.06％，沉香醇浸出物與結(jié)香方式、種源無(wú)相關(guān)性，沉香四醇含量高低與種源、結(jié)香方式有一定的相關(guān)性(A.sinensis人工和天然沉香的沉香四醇平均含量分別為0.67％、0.15％，兩者比較有顯著差異，天然沉香中種源為A.malaccensis與A.crassna中沉香四醇平均含量分別為2.57％、0.70％，兩者有差異，且與A.sinensis(0.15％)有顯著差異）。
　　(

9、2)基于GCMS聯(lián)用技術(shù)經(jīng)過(guò)多元統(tǒng)計(jì)和單維統(tǒng)計(jì)分析篩選出不同種源和結(jié)香方式沉香的差異標(biāo)志物共19個(gè)，分別為5個(gè)2-2-苯乙基色酮類成分、5個(gè)倍半萜類和其他類。通過(guò)OPLS-DA分析，A.sinensis人工結(jié)香和天然沉香樣品有13個(gè)差異標(biāo)志成分為色酮類、倍半萜類、烷烴類，其中2-（2-苯乙基）色酮、6，7-二甲氧基-2-（2-苯乙基）色酮、5,8-Dihydroxy-4a-methyl-4,4a,4b,5,6,7,8,8a,9,10-d

10、ecahydro-2(3 H)-phenanthrenone(isomer1)、三十一烷(isomer3)4個(gè)成分在兩組間具有顯著差異;A.crassna人工結(jié)香和天然結(jié)香樣品中的差異成分為2個(gè)倍半萜類成分;同時(shí)兩種不同種源人工結(jié)香沉香(A.sinensis和A.crassna人工結(jié)香沉香)的差異標(biāo)志物有2個(gè)，其中5，8-Dihydroxy-4a-methyl-4,4a,4b,5,6,7,8,8a,9,10-decahydro-2(3H

11、)-phenanthrenone(isomer1)在兩組間具有顯著差異;通過(guò)對(duì)三個(gè)種源天然沉香對(duì)比分析，A.sinensis沉香與A.crassna沉香和A.malaccensis沉香的均有7個(gè)差異標(biāo)志物，它們中具有顯著差異的標(biāo)志性成分均為三十一烷（isomer3），而其他組間并未發(fā)現(xiàn)具有顯著差異的成分。
　　對(duì)52個(gè)沉香樣品中烷烴類、倍半萜和2-（2-苯乙基）色酮類成分峰面積進(jìn)行歸納分類并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明天然沉香中倍半萜含

12、量較高多為A.crassna、A.malaccensis沉香，同時(shí)2-（2-苯乙基）色酮含量較高的也同樣為A.crassna、A.malaccensis沉香，而烷烴類較高的則主要A.sinensis天然沉香;對(duì)各組間不同類型成分的總峰面積比較分析表明在A.sinensis沉香中人工和天然結(jié)香樣品中在烷烴類成分無(wú)顯著差異，而倍半萜和2-（2-苯乙基）色酮均存在差異，且人工結(jié)香沉香均高于天然沉香;A.crassna沉香中人工和天然沉香間則顯

13、示各類成分并無(wú)顯著差異;從兩組人工沉香(A.sinensis和A.crassna)樣品比較分析，各類成分并無(wú)顯著差異;三種天然沉香對(duì)比分析，其中A.sinensis天然沉香與A.malaccensis天然沉香在烷烴類和倍半萜類均存在差異，而A.sinensis天然沉香與A.crassna天然沉香僅在烷烴類成分存在差異，其他組別和成分間并無(wú)顯著差異。聚類分類顯示人工沉香多能聚為一類，多數(shù)天然沉香也能夠聚為一類。
　　(3)基于LCM

14、S聯(lián)用儀對(duì)不同組別沉香樣品進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)學(xué)和單維統(tǒng)計(jì)分析，找出123個(gè)差異標(biāo)志物，通過(guò)一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜結(jié)合已有文獻(xiàn)，鑒別出62個(gè)化合物，其中23個(gè)為潛在新化合物。
　　對(duì)同一種源人工沉香和天然沉香的比較分析，在A.sinensis沉香中發(fā)現(xiàn)45個(gè)差異物，15個(gè)具有顯著差異，而其中6個(gè)成分（2-(2-苯乙基)色酮、7-羥基-2-（2-苯乙基）色酮、6-甲氧基-2-（2-苯乙基）色酮(isomer2)、6，8-二羥基-2-（2-苯乙基）色

15、酮(isomer1)、6-甲氧基-2-[2-（4'-甲氧基苯基）乙基]色酮、dehydroxy AH21）是A.sinensis中人工沉香和天然沉香間的主要標(biāo)志性差異物，而A.crassna中人工沉香和天然沉香間的差異物有29個(gè)，具有顯著差異有7個(gè)，其主要標(biāo)志性差異物為6，8-二羥基-2-（2-苯乙基）色酮(isomer1)，AH21(isomer1)、methoxy AH21(isomer1)、2，3-二羥基-5-苯乙基-2，3-二氫

16、-1 ah-oxireno[2,3-f]chromen-7(7bh)-one(isomer2)、dehydroxy AH21(isomer2)5個(gè)成分。對(duì)同一結(jié)香方式不同種源沉香的比較分析，A.sinensis與A.crassna的人工沉香間的差異物有36個(gè)，其中具有顯著差異的3個(gè)，AH12(isomer3)為該兩組人工沉香中的主要標(biāo)志性差異物。在天然沉香中，A.sinensis與A.malaccensis沉香的差異物有35個(gè)，具有顯著

17、差異13個(gè)，其主要標(biāo)志性差異物為6-甲氧基-2-[2-（4'-羥基-3'-甲氧基苯基）乙基]色酮(isomer2)、6，8-二羥基-2-[2-（3'-羥基-4'-甲氧基苯基）乙基]色酮(isomer2)、沉香四醇、6-羥基-7-甲氧基-2-[2-（4'-羥基-3'-甲氧基苯基）乙基]色酮(isomer2)、2，3-二羥基-5-苯乙基-2，3-二氫-1 ah-oxireno[2，3-f]chromen-7(7bh)-one(isomer1

18、)等5個(gè)成分;A.crassna與A.malaccensis沉香中的差異物有20個(gè)，具有顯著差異2個(gè)，其主要標(biāo)志性差異物則為6-甲氧基-2-[2-（4'-羥基-3'-甲氧基苯基）乙基]色酮(isomer2)、6，8-二羥基-2-[2-（3'-羥基-4'-甲氧基苯基）乙基]色酮(isomer1))，其中其中6-甲氧基-2-[2-(4'-羥基-3'-甲氧基苯基)乙基]色酮(isomer2)是A.malaccensis與A.sinensis和

19、A.crassna種天然沉香共同的主要標(biāo)志性差異物;而A.sinensis與A.crassna沉香的差異物有6個(gè)，并未發(fā)現(xiàn)有顯著差異成分。同時(shí)結(jié)果顯示具有顯著共性特征苯環(huán)上羥基和甲氧基取代的2-（2-苯乙基）色酮類成分可能為有效辨識(shí)人工和天然沉香的標(biāo)志性成分，而5，6，7，8-四氫-2-（2-苯乙基）色酮類和雙2-（2-苯乙基）色酮類成分則是區(qū)分不同種源沉香的關(guān)鍵物質(zhì)。
　　對(duì)不同組別沉香的四種類型的2-(2-苯乙基)色酮類成分的

20、峰面積進(jìn)行比較研究，結(jié)果表明各組之間差異有所不同，5，6，7，8-四氫-2-（2-苯乙基）色酮類成分、雙2-（苯乙基）色酮類、三2-（苯乙基）色酮類成分在各組間多具有顯著差異;同時(shí)基于2-（2-苯乙基）色酮類成分對(duì)所有樣品進(jìn)行聚類分類顯示人工和天然沉香多各自聚為一類。
　　結(jié)論:
　　本文基于GCMS和LCMS技術(shù)，結(jié)合多維和單維統(tǒng)計(jì)建立了篩選沉香差異成分的方法。通過(guò)GCMS結(jié)合NIST14質(zhì)譜庫(kù)鑒定出19個(gè)差異成分，其中具

21、有顯著差異的有4個(gè)成分;本文首次基于LC-ESI-QTOF高分辨質(zhì)譜結(jié)合文獻(xiàn)從沉香中鑒定出62個(gè)差異成分，其中23個(gè)為潛在的新雙2-（2-苯乙基）色酮類化合物，通過(guò)多維和單維統(tǒng)計(jì)分析的方法，篩選出具有顯著差異的有27個(gè);這些標(biāo)志性成分可以作為沉香的品種鑒定、質(zhì)量控制及化學(xué)分類學(xué)指標(biāo)成分。人工沉香和天然沉香的差異可能與苯環(huán)上有羥基和甲氧基取代的2-（2-苯乙基）色酮類成分密切相關(guān);5，6，7，8-四氫-2-(2-苯乙基)色酮類和雙2-（2

22、-苯乙基）色酮類成分則是區(qū)分不同種源沉香的關(guān)鍵物質(zhì)。對(duì)不同類型成分進(jìn)行歸類分析，烷烴類、倍半萜類和2-（2-苯乙基）色酮類成分的高低在一定程度上能夠反映沉香內(nèi)在質(zhì)量差異，烷烴類成分越低，倍半萜類和2-（2-苯乙基）色酮類含量越高，其沉香樹脂含量越多，其質(zhì)量可能越好，反之，其質(zhì)量則越差;通過(guò)沉香內(nèi)在成分聚類研究，人工和天然沉香多各自聚為一類，不同組別的多能聚為一類，該方法能很好地將不同質(zhì)量的沉香進(jìn)行聚類和區(qū)分。本文能夠?yàn)槌料愕钠贩N鑒別、質(zhì)