中藥藥效成分分析中的色譜新方法研究.pdf

1、隨著中藥現(xiàn)代化進(jìn)程的不斷前進(jìn),中藥藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)、藥理學(xué)、藥物代謝過程及相關(guān)的生物學(xué)、藥物的質(zhì)量控制等等方面的研究越來越成為中藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵問題。運(yùn)用現(xiàn)代分析儀器,發(fā)展高效的分離分析手段和方法,為解決此類問題提供了一個(gè)契機(jī)。色譜作為一種現(xiàn)代分離分析手段,在中藥的開發(fā)和研究方面發(fā)揮了非常重要的作用,尤其是在中藥有效成分的定性定量分析及質(zhì)量控制上。但是中藥成分復(fù)雜,結(jié)構(gòu)多樣性、含量差別等等干擾分析的因素諸多。單純采用單一色譜系統(tǒng),不能提供中

2、藥全面的信息。利用多種色譜模式的串聯(lián),以及其與其他化學(xué)、生物技術(shù)的有效結(jié)合,可以從不同角度探討中藥的化學(xué)組成,以及相關(guān)的藥效關(guān)系,更好地解決中藥復(fù)雜體系的分離與分析,并為高通量篩選中藥中有效組分提供物質(zhì)依據(jù)。
　　 本論文主要發(fā)展和研究了以色譜分離技術(shù)為基礎(chǔ)的多種分離分析模式,包括建立納升液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)用于中藥中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量分析;優(yōu)化多維色譜系統(tǒng)用于中藥分離;以兩維色譜為基礎(chǔ)結(jié)合體外酶模型和細(xì)胞模型查找相關(guān)的有效成分;利用新型材

3、料固定靶酶,通過色譜/質(zhì)譜等技術(shù)檢測固定酶的活性并運(yùn)用于相關(guān)抑制劑的篩選。具體的研究工作和成果的摘要如下:
　　 第一章作為前言簡單回顧了中藥現(xiàn)代化的發(fā)展,闡述了中藥藥效研究的基本思路和策略;綜述了中藥研究中的各類化學(xué)分析方法;重點(diǎn)描述了色譜在中藥研究中的重要作用和近幾年來的發(fā)展,以色譜分析前的預(yù)處理提取方法為始,舉例說明了新型色譜技術(shù)在中藥定性定量剖析、復(fù)雜體系分離分析以及高通量藥物篩選中的研究和應(yīng)用。同時(shí)也概述了其他新技術(shù)新

4、方法與色譜分析技術(shù)結(jié)合在中藥組分分析中的新進(jìn)展和應(yīng)用。通過現(xiàn)狀描述和前景評估,闡明了本課題選題和研究的學(xué)術(shù)背景和技術(shù)意義。
　　 第二章主要研究和考察了色譜分析技術(shù)在中藥質(zhì)量控制中的應(yīng)用,建立了納升級液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng),利用色譜的高效分離能力和質(zhì)譜的靈敏性,用于中藥復(fù)雜體系的定性定量分析。此前,關(guān)于液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)用于中藥有效成分定性定量分析的報(bào)道較少,尤其是低濃度中藥的痕量物質(zhì)分析。以金銀花為例,我們首次使用納升色譜/質(zhì)譜聯(lián)用(

5、nano-LC/MS)鑒定和定量中藥中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。比較色譜保留時(shí)間和質(zhì)譜結(jié)構(gòu)解析的信息,快速專一地確認(rèn)金銀花中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)綠原酸的定性信息;通過對綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作,建立綠原酸外標(biāo)法的定量標(biāo)準(zhǔn)。作為分離前預(yù)處理方法的優(yōu)化,考察了不同提取方法,包括微波輔助萃取的新方法,常規(guī)提取方法,如回流萃取,超聲萃取等對金銀花中綠原酸的萃取效率。比較顯示微波輔助萃取能夠在較短時(shí)間內(nèi),即4分鐘之內(nèi),提供較好的提取效率。同時(shí),液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)用于定性定量分析的有

6、效性和可靠性也經(jīng)過考察方法的線性、檢測限、準(zhǔn)確性和回收率得到確認(rèn)。結(jié)果顯示方法的線性范圍在0.8-20ng/mL,相關(guān)指數(shù)R2在0.991,檢測限為0.5ng/mL,標(biāo)準(zhǔn)偏差2.54％,回收率84.8％。Nano-LC/MS和微波輔助萃取的結(jié)合,綜合了兩者快速分析、減少樣品損耗、節(jié)約時(shí)間、降低試劑成本等優(yōu)點(diǎn),可用于中藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定量和定性評估,尤其對于那些含量較少的痕量物質(zhì)更能體現(xiàn)其優(yōu)勢。
　　 第三章建立和優(yōu)化了離線的兩維色譜

7、系統(tǒng)用于中藥組分的分離,提高了色譜分離的峰容量和分辨力,解決了兩維間兼容性問題。首先將中藥千層塔在第一維色譜進(jìn)行初步分離,這里選用分辨率相對較低的CN柱和甲醇/水流動(dòng)相作為第一維。按照時(shí)間搜集各組流分后,再將這些流分通過第二維色譜進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)分。第二維色譜采用ODS和乙腈/水的反相色譜模式。為了考察這種色譜模式的有效性和兼容性,將不同提取時(shí)間和不同產(chǎn)地的千層塔作為目標(biāo)物進(jìn)行分離。不同的譜圖表現(xiàn)證實(shí)了這種離線兩維系統(tǒng)的高分辨能力。相對一

8、維色譜,兩維色譜系統(tǒng)能可靠地提供中藥更多的信息,為藥物的鑒定和后期的藥效藥理研究提供必要的分離基礎(chǔ)。
　　 第四章重點(diǎn)開發(fā)了以酶為藥物靶點(diǎn)的有效組分篩選系統(tǒng),利用酶的特異性結(jié)合和色譜、質(zhì)譜的高效分離鑒定能力快速有效地確認(rèn)中藥組分中的有效成分,實(shí)現(xiàn)了有效成分確定、分離的嫁接。將糖尿病治療中的關(guān)鍵酶α-葡萄糖苷酶,通過乙醛基團(tuán)與氨基基團(tuán)的作用,借助戊二醛的螯合基團(tuán)固定在氨基磁性納米微球上。固定化的酶用于底物的水解反應(yīng),通過高效液相色

9、譜考察產(chǎn)物產(chǎn)量的變化評估酶的催化活性。與傳統(tǒng)的生物檢測方法比較,這種預(yù)制備的固定化酶在活性的高低和系統(tǒng)穩(wěn)定性上都有更好的表現(xiàn),并且能夠簡單地重復(fù)利用10次左右。在確認(rèn)固定酶的系統(tǒng)穩(wěn)定性前提下,將固定酶和色譜檢測結(jié)合的方式用于考察己知臨床藥物和幾味中藥對該酶的抑制作用。通過色譜檢測產(chǎn)物增加和減少,可以簡單直觀地評價(jià)固定酶的活性和抑制劑的抑制作用的強(qiáng)度。該方法通用于各類蛋白酶活性監(jiān)測,并且具有產(chǎn)物易分離,成本較低,試劑消耗更有效率的優(yōu)點(diǎn)。<

10、br>　　 此外,還選用了治療老年癡呆癥的關(guān)鍵活性酶,乙酰膽堿酯酶作為對象,考察磁性微米硅球固定酶的性能。乙酰膽堿酯酶固定于3-(2,3-環(huán)氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(GLYMO)修飾的磁性微米硅球上,與標(biāo)準(zhǔn)底物乙酰膽堿一起反應(yīng)后,利用磁性將底物與產(chǎn)物快速分離。電噴霧質(zhì)譜作為快速定性和半定量方法用于測定產(chǎn)物量的變化,并以此作為酶活性的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。比較同一組固定酶的5次重復(fù)酶促反應(yīng),沒有明顯的活性變動(dòng),固定酶的穩(wěn)定性得以確認(rèn)。磁球固定的酶也

11、用于酶抑制劑的篩查,已知乙酰膽堿酯酶抑制劑石杉堿甲和石杉堿乙,與固定酶一起參與酶促水解反應(yīng),酶活性的鈍化和產(chǎn)物離子峰的改變證明了固定酶和質(zhì)譜檢測在篩選酶抑制劑中的可行性和可靠性。
　　 另外,新型介孔材料FDU-12也用于制作固定酶的微酶反應(yīng)器。介孔的三維立體有序排列促進(jìn)了分子的擴(kuò)散和運(yùn)輸,從而形成了酶濃度增高和底物富集效應(yīng)。酶反應(yīng)器的有效應(yīng)用為發(fā)展有效、生物兼容、多功能的納米反應(yīng)器用于高通量多靶點(diǎn)藥物的篩選和研究提供了基礎(chǔ)。<

12、br>　　 第五章則拓展了多維色譜與生物技術(shù)的聯(lián)用,運(yùn)用兩維色譜的高分辨分離和正交性,簡化中藥初篩步驟,降低篩選成本。結(jié)合酶模型、細(xì)胞模型的高特異選擇性,不僅可以發(fā)現(xiàn)中藥中的有效成分,而且還能從抑制酶活性和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡兩條路徑解釋中藥作用的機(jī)理。同時(shí)借助多孔板、自動(dòng)流分收集器、酶標(biāo)儀等現(xiàn)代自動(dòng)化、產(chǎn)量化技術(shù),建立中藥活性篩選的高通量模型。在酶分子水平上,我們選用了糖尿病代謝中的關(guān)鍵酶α-葡萄糖苷酶模型和離線兩維色譜結(jié)合,作為兩維色譜和

13、酶模型聯(lián)用的方法研究。首先建立和優(yōu)化離線兩維色譜分離黃芪中的各類組分,用于體外酶解實(shí)驗(yàn),初步確定有效區(qū)域。然后將有效區(qū)域通過色譜進(jìn)一步分離,細(xì)分后的流分再通過體外酶試驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)更準(zhǔn)確的有效物質(zhì)。最后將已經(jīng)確認(rèn)的幾個(gè)有效物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜的結(jié)構(gòu)解析,將這些結(jié)果與己知標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行對比,其中主要為已知的有效成分黃酮和異黃酮類。這是首次將兩維色譜與體外生物實(shí)驗(yàn)結(jié)合篩查中藥中的有效成分,充分利用了兩維色譜的高分辨率和生物試驗(yàn)的靈敏性。
　　 將

14、這種系統(tǒng)擴(kuò)展到體外細(xì)胞模型上,利用兩維色譜分離黃連中的各個(gè)流分,然后將其與肝癌細(xì)胞一起培養(yǎng),通過觀察細(xì)胞的凋亡情況,找到促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的有效物質(zhì)。從細(xì)胞水平上更有力地證明了兩維色譜分離系統(tǒng)在藥物開發(fā)和研究中的重要作用。
　　 簡言之,本論文的主要工作是考察了色譜/質(zhì)譜技術(shù)在質(zhì)量控制中的應(yīng)用,建立了兩維色譜分離系統(tǒng),并首次將其與體外靶酶和細(xì)胞模型結(jié)合,篩查中藥中的有效組分。同時(shí)也合成了一些新型材料,固定糖尿病和老年癡呆的關(guān)鍵酶,