中藥有效成分分析的新方法新技術研究.pdf

1、本論文以尋找中藥有效成分為出發(fā)點，以色譜、質譜技術為基礎，嘗試探索中藥研究的新方法和新技術。建立了以提取手段、色譜質譜聯(lián)用技術、基于細胞模型的活性成分篩選技術互相搭配的分離分析手段用于中藥有效成分的提取、分離、篩選和鑒定；同時，針對中藥復方方劑的配伍比例進行了優(yōu)化探索，并采取先分解再組合的實驗思路建立基于中藥復方疊加效應的有效成分篩選方法，并搭建了兩維色譜體系用于分離復方中藥中的復雜成分，從而實現(xiàn)了在綜合考量中藥多組分、多靶點、多效應特

2、點上的較為全面的活性物質分離鑒定；此外，以基質輔助激光解吸飛行質譜(MALDI-TOF-MS)為出發(fā)點，通過采用新基質成功實現(xiàn)了高通量的中藥化合物篩選及長鏈脂肪酸富集；在此基礎上，將MALDI-TOF-MS篩查擴展到了固定酶抑制劑的高通量篩查，從而擴寬了高通量MALDI-TOF-MS技術的篩查范圍。相關研究工作及成果的摘要如下：
　　 第一章文獻綜述部分充分描述了中藥的豐富內涵，突出了中藥有效成分在中藥質量篩查中的重要性，以及探

3、索中藥藥效機理對于藥物篩選與研發(fā)的必要性；介紹了色譜技術作為一種現(xiàn)代高效分離工具在中藥研究方面的發(fā)展與應用；闡述了針對中藥有效成分研究的各種提取技術，圍繞中藥多組分、多靶點、多效應等特點展開的數(shù)學實驗思考，以及對于中藥有效成分篩查的體外生物模型研究方法；同時，詳細描述了在化合物分離鑒定方面發(fā)揮重要作用的多維色譜、質譜技術，概述了當前應用于中藥分離的多維色譜模式以及在中藥研究中逐漸展露身手的質譜鑒定技術。從中藥的提取預處理、到數(shù)學思維綜合

4、考量、到多維色譜高效分離、到生物模型科學篩分、到質譜技術高通量鑒定等多種化學生物技術相互結合的方式，對于中藥有效成分的分析具有十分重要的意義。通過描述該研究的基本思路和進展狀況，闡明了本課題選題及研究的學術意義和技術背景。
　　 第二章將提取、分離、篩選、鑒定技術互相搭配，從而實現(xiàn)對中藥有效成分的分離分析。以中藥半枝蓮為分析樣本，探索不同提取方法對于其中有效成分-野黃芩苷的提取效率。通過納升級的色譜＼質譜聯(lián)用模式來定性鑒定和定量

5、測量經過紅外提取后的半枝蓮中的成分野黃芩苷。同時，紅外提取的各個過程各個實驗參數(shù)都進行了優(yōu)化，從而驗證了該提取方法的可靠性及高效性。同時，通過與其他幾種提取方法，例如常規(guī)的加熱回流方法、超聲提取方法、微波提取方法等進行比較可知，紅外提取能夠獲得更高的提取效率。同時，中藥半枝蓮在納升級色譜質譜聯(lián)用模式下得到了有效分離。通過參照野黃芩苷標準品的色譜保留時間及質譜結構信息，即可以快速準確的確定半枝蓮中野黃芩苷的相關信息，從而實現(xiàn)高效定性鑒定。

6、此外，通過建立野黃芩苷標準曲線從而獲得相應的定量信息，進而得到較為滿意的方法有效性、線性以及檢測限。結果顯示，該方法在0.6至20ng mL-1范圍內線性良好，相關系數(shù)(R2)為0.9973，檢測限(LOD)為0.5ng mL-1(S/N=3)。
　　 第三章將中藥復方作為分析對象，以探索復方配伍合理性，考量復方藥效疊加作用以及分析復方中藥復雜組分為出發(fā)點，通過提取優(yōu)化、生物檢測細胞模型、兩維色譜分離及高效準確質譜鑒定等技術，嘗

7、試從更為全面的角度來分析紛繁復雜的中藥有效成分。首先，從探究復方方劑的配伍比例合理性出發(fā)，針對特定的中藥復方方劑(該方劑由三種單味藥)，在結合細胞生物篩查效果的基礎上，進行方劑配伍比例值的優(yōu)化探索；其次，鑒于中藥各個組分之間的藥效疊加效應，從整體著眼，根據(jù)先分解再組合的思想重新進行細胞增殖生物篩查，進而從更為全面的角度對有效成分進行篩查；然后，以紫杉提取液為實驗對象，繼續(xù)按照先分解再整合的實驗思路對其中的有效成分進行篩查，根據(jù)實驗結果，

8、紫杉醇被確定為其中的有效成分，從而驗證了這一篩選方法的有效性；最后，將親水色譜柱和反相色譜柱相結合，搭建兩維色譜分離系統(tǒng)，經過驗證，該系統(tǒng)具有更好的正交性和更高的峰容量，繼而將此兩維色譜分離體系與細胞模型、質譜鑒定相結合，從而實現(xiàn)高通量的藥物篩選，對于藥物研發(fā)及藥物篩查具有重要意義。
　　 第四章以基質輔助激光解吸飛行質譜(MALDI-TOF-MS)為出發(fā)點，將石墨烯和氧化石墨烯用作MALDI基質，來鑒定傳統(tǒng)中藥化合物。由于石墨

9、烯和氧化石墨烯的表面積較大，從而避免了MALDI離子源與真空系統(tǒng)的污染。同時，由于石墨烯優(yōu)異的電學、熱學以及機械性能使得MALDI-TOF-MS可以在濃度為100nM時達到穩(wěn)定的分析，且免除背景噪音干擾。實驗采用當歸和半枝蓮做為檢測樣本，將當歸中的阿魏酸(m/z194)、半枝蓮中的野黃芩苷(m/z462)及漢黃芩素(m/z284)作為檢測的目標化合物。實驗表明，這兩種MALDI基質對于中藥中組分的不同濃度不具有歧視效果。此外，石墨烯和氧

10、化石墨烯還可以作為樣品的吸附劑展示其富集功效，從而使被測物的檢測限獲得較大幅度的降低。實驗表明，這種MALDI-TOF-MS方法具有簡單靈敏、快速經濟、以及高通量等突出特點，可以為中藥快速質量篩查提供新的技術手段。
　　 此外，還將石墨烯和氧化石墨烯用于富集長鏈脂肪酸。將5種長鏈脂肪酸，即十二烷酸(C12)、十四烷酸(C14)，十六烷酸(C16)，十八烷酸(C18)和二十烷酸(C20)，用作為代表性樣本。由于石墨烯或氧化石墨烯較

11、大的表面積和強烈相互作用，這5種長鏈脂肪酸被石墨烯和氧化石墨烯有效富集，實現(xiàn)了高通量的檢測。同時，本方法還可以成功用于低濃度下檢測實際生物樣品中的5種長鏈脂肪酸樣本，從而證明了這種MALDI-TOF-MS方法可以實現(xiàn)簡單靈敏、快速經濟并且高通量的檢測長鏈脂肪酸。
　　 第五章則在上述MALDI-TOF-MS檢測技術的基礎上，將這種高通量篩查技術用于酶抑制劑的篩選中，該篩選由固定酶磁性碳球和以氧化石墨烯為基質的MALDI-TOF-

12、MS結合完成。首先，將乙酰膽堿酯酶(AChE)固定于3-glycidoxypropyltrimethoxysilane(GLYMO)修飾的磁性碳球上，該固定酶磁性碳球具有高效的酶活性和穩(wěn)定性，并可以將酶從底物和產物中有效分離出來。固定化乙酰膽堿酯酶AChE的效率則通過固定酶磁性碳球和樣品底物之間的反應加以驗證，而后續(xù)的定量分析底物乙酰膽堿和產物膽堿則通過基于氧化石墨烯為基質的MALDI-TOF-MS方法完成，該MALDI-TOF-MS方

13、法沒有背景干擾。乙酰膽堿的檢測限LOD是0.25 fmol/μL，在0.5至250 fmol/μL范圍內有良好的線性值(R2=0.9998)。而膽堿則在0.05至15 pmol/μL內有很好的線性(R2=0.9994)和低檢測限LOD(0.15 fmol/μL)。在標準曲線的濃度范圍內有良好的準確度和精確度。共有8種化合物(4種已知乙酰膽堿酯酶AChE抑制劑和4種沒有乙酰膽堿酯酶AChE抑制效果的對照化合物)用此方法進行驗證，所得結果證

14、明該高通量篩分方法可以大大推動日常酶抑制劑篩選的進程。
　　 總體而言，本論文圍繞中藥有效成分研究為核心，以色譜、質譜技術為基礎，著重發(fā)展新方法和新技術。首先，建立了包含提取、分離、篩選、鑒定的操作技術方法；其次，圍繞中藥復方這一復雜體系，著重優(yōu)化復方配伍比例值，探索基于復方藥效疊加作用基礎上的有效成分篩選方法，建立兩維色譜分離模式以實現(xiàn)更為全面的中藥復方分離分析；同時，將MALDI質譜技術成功用于中藥分子檢測及長鏈脂肪酸富集，

15、從而為高通量的中藥質量篩查提供新的技術基礎；最后，固定酶抑制劑的高通量MALDI檢測的實現(xiàn)，大大拓寬了該MALDI質譜檢測新技術的應用領域，具有極大潛力。本論文以色譜質譜等現(xiàn)代儀器手段為基礎，結合生物模型，著重發(fā)展中藥有效成分分離分析的新方法新技術。以高效靈敏、準確可靠的分離、篩選、鑒定中藥中的有效成分為目標，發(fā)展了包含提取手段、分離鑒定、基于細胞模型的活性成分篩選、高通量中藥化合物鑒定等新技術和新方法，為中藥有效成分的分離分析提供了較