枯草芽孢桿菌N2-10菌株木質(zhì)纖維素酶基因克隆與表達(dá).pdf

1、本研發(fā)團(tuán)隊(duì)研制出的多功能微生物菌劑發(fā)酵秸稈后能夠有效改變其細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)，提高秸稈的纖維素利用率。發(fā)酵菌劑中的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)N2-10菌株對秸稈木質(zhì)纖維素有較強(qiáng)的降解作用。本研究旨在通過對枯草芽孢桿菌N2-10菌株進(jìn)行基因組測序及分析，克隆木質(zhì)纖維素酶相關(guān)基因，為闡明發(fā)酵菌劑降解秸稈木質(zhì)纖維素的機(jī)理提供理論依據(jù)。研究內(nèi)容如下:
　　利用Illumina高通量測序平臺(tái)對B.subtilis N2-1

2、0菌株進(jìn)行基因組測序，基因組大小為4，031，619bp，GC含量為43.76％;含有4083個(gè)基因，其中包括65個(gè)tRNA，1個(gè)tmRNA，1個(gè)rRNA，4016個(gè)CDS;通過KEGG代謝通路注釋和GO功能注釋獲得了3個(gè)木質(zhì)纖維素降解酶基因，分別為內(nèi)切葡聚糖酶基因、木聚糖酶基因、漆酶基因。
　　從B.subtilis N2-10菌株中克隆了內(nèi)切葡聚糖酶基因，基因全長1500bp，ORF長度為1500bp，編碼499個(gè)氨基酸，同G

3、enBank中其它芽孢桿菌內(nèi)切葡聚糖酶的氨基酸序列進(jìn)行Blastp比對，同源性在93％以上。利用NCBI數(shù)據(jù)庫中CDD軟件對β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶功能保守域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白具有纖維素酶特異性位點(diǎn)，屬于糖苷水解酶家族5，并且具有CBM3纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中表達(dá)的融合蛋白具有內(nèi)切葡聚糖酶活性，酶活力為93.197U/mL。
　　從B.subtilis N2-10菌株中克隆了木聚糖酶基因，基因全長6

4、42bp，ORF長度為642bp，編碼213個(gè)氨基酸，同GenBank中已報(bào)道的其它芽孢桿菌木聚糖酶的氨基酸序列進(jìn)行Blastp比對，同源性在90％以上。利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的CDD軟件對木聚糖酶功能保守域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白含有典型的糖苷水解酶11族的催化結(jié)構(gòu)域。在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中表達(dá)的融合蛋白具有木聚糖酶活性，酶活力為24.347U/mL。
　　從B.subtilis N2-10菌株中克隆了漆酶cotA基因，基

5、因全長1542bp，ORF長度為1542bp，編碼513個(gè)氨基酸，同GenBank中已報(bào)道的枯草芽孢桿菌漆酶的氨基酸序列進(jìn)行Blastp比對，同源性在99％以上。利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的CDD軟件對該漆酶功能保守域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白屬于銅氧化酶超家族，具有3個(gè)銅氧還原素結(jié)構(gòu)域。在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中表達(dá)的融合蛋白具有漆酶活性，酶活力為108.333U/L。
　　本研究分別克隆了枯草芽孢桿菌N2-10菌株的內(nèi)切葡聚糖酶基