枯草芽孢桿菌S44菌株ituD基因克隆、表達及其脂肽類抗生素生物活性研究.pdf

1、目的：為了明確枯草芽孢桿菌S44防治植物病害及抑制病原菌生長的機理，通過特異性引物PCR擴增技術(shù)克隆ituD基因，并對ituD基因進行了原核表達。明確枯草芽孢桿菌S44產(chǎn)IturinA。通過進一步發(fā)酵提取與該基因密切相關(guān)的脂肽類粗提物，對其抑菌活性、理化性質(zhì)、作用機制及發(fā)酵工藝進行研究，進而提高脂肽類抗生素的產(chǎn)量，最終使枯草芽孢桿菌S44發(fā)揮更好的防病效能。
　　方法：通過特異性引物PCR擴增技術(shù)進行ituD基因的克隆與原核表達；

2、通過濃鹽酸沉淀、甲醇抽提法提取iturin粗提物，采用平皿對峙法測定其抑菌活性及理化性質(zhì)，并觀測粗提物對病原菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響；通過單因素實驗和響應(yīng)面分析相結(jié)合的統(tǒng)計方法優(yōu)化獲iturin粗提物最大產(chǎn)量的發(fā)酵工藝。研究結(jié)果如下：
　　結(jié)果：1、本研究通過特異性引物PCR擴增技術(shù)克隆了枯草芽孢桿菌S44菌株ituD基因，序列分析表明，該基因全長為1203bp，編碼400個氨基酸，與已報道的ituD氨基酸序列同源性為85％。同

3、時構(gòu)建了原核生物表達載體pET28a（+）-ituD，對不同的IPTG誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時間等條件的優(yōu)化結(jié)果表明，37℃6h能誘導(dǎo)ituD融合蛋白的最大量表達,在0.5mmol/LIPTG濃度下可以成功表達出ituD蛋白。為進一步研究其表達蛋白的生物學(xué)機制、功能及其與iturinA的合成奠定基礎(chǔ)。
　　2、通過甲醇抽提法獲得脂肽粗提物，用平皿對峙法分別檢測枯草芽孢桿菌S44的iturins粗提物對番茄早疫病菌、大豆立枯絲核菌、棉花黃萎

4、病菌、西瓜枯萎病菌及瓜果腐霉病菌5種供試病原菌的抑菌活性。結(jié)果表明，該粗提物對番茄早疫病菌的抑菌效果最好，對西瓜枯萎病菌、大豆立枯病菌及棉花黃萎病菌次之。
　　3、枯草芽孢桿菌S44的iturins粗提物在紫外燈下分別照射1h、2h和4h及在自然光下照射3h、6h和12h；在60℃、80℃、100℃（電熱恒溫水槽內(nèi)進行）、121℃（高壓鍋內(nèi)進行）條件下處理30min，表現(xiàn)出了良好的耐受紫外線照射和耐熱性。iturins粗提物在pH

5、范圍以及乙醚、異丙醇、乙酸乙酯、丙酮和氯仿5種有機溶劑處理條件下表現(xiàn)出了很好的酸堿穩(wěn)定性和耐有機溶劑的特性；該粗提物對蛋白酶K處理不敏感。上述特征進一步表明該粗提物為一種脂肽類物質(zhì)。
　　4、隨著稀釋倍數(shù)的增大，粗提物抑菌活性逐漸降低，稀釋64倍后，粗提物抑菌效果不明顯。用粗提物處理的番茄早疫菌菌絲形態(tài)變化顯著，菌絲斷裂、頂端膨大、腫脹畸形；細胞膜破裂、原生質(zhì)釋放；粗提物對孢子具有強烈的抑制作用，孢子變畸形，抑制孢子萌發(fā)。

6、　　5、將iturins粗提物純化，經(jīng)反相HPLC與標(biāo)準(zhǔn)品進行比對，結(jié)果顯示樣品的主峰與標(biāo)準(zhǔn)品IturinA的一特征峰保留時間基本一致，因此樣品含有IturinA的組分。
　　6、用PD、PS、YPG和Landy四種不同培養(yǎng)基發(fā)酵枯草芽孢桿菌S44，初步確定采用PD和YPG培養(yǎng)基發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物中脂肽粗提物產(chǎn)量較高，對番茄早疫病菌、大豆立枯絲核菌、棉花黃萎病菌、西瓜枯萎病菌4種供試病原真菌的抑菌圈最大。以PD和YPG培養(yǎng)基通過響應(yīng)面