枯草芽孢桿菌脂肽化合物合成調(diào)控基因功能研究及多功能生防工程菌株的構(gòu)建.pdf

1、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)具有生長(zhǎng)速度快，代謝產(chǎn)物豐富，利用開(kāi)發(fā)價(jià)值高以及食用安全等顯著優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生物防治。研究枯草芽孢桿菌快速分子鑒定方法以獲得更多具有應(yīng)用價(jià)值的新菌株具有重要意義. 采用16S rDNA序列分析法對(duì)本實(shí)驗(yàn)室采用傳統(tǒng)方法鑒定的枯草芽孢桿菌菌株B3、38、43、49、55、85進(jìn)行鑒定結(jié)果表明：測(cè)定的芽孢桿菌菌株與己報(bào)道的枯草芽孢桿菌屬具有高度的同源性，其中B3、38、43、49

2、、55、85菌株的16S rDNA與模式菌株168的同源性分別為99.4％、99.5％、99.7％、93.8％、96.8％和99.4％。B3的16S rDNA序列已經(jīng)登錄到了GenBank上，登錄號(hào)為：EF492885。應(yīng)用DNAstar軟件對(duì)這些序列進(jìn)行分析，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，B3、38、43、49、55、85與枯草芽孢桿菌模式菌株168聚在一起，說(shuō)明它們的親緣關(guān)系較近. 基質(zhì)協(xié)助激光解吸附/電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-

3、assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新的質(zhì)譜離子化技術(shù)，通過(guò)對(duì)細(xì)菌成分的分析，來(lái)鑒定細(xì)菌的類別。為快速準(zhǔn)確鑒定枯草芽孢桿菌，本研究采用MALDI-TOF-MS對(duì)本實(shí)驗(yàn)室分離保存的枯草芽孢桿菌菌株B3、38、43、49、55、85進(jìn)行分析，以來(lái)自美國(guó)菌種保藏中心菌株168、ATCC6633

4、、ATCC13952、ATCC21332，及柏林理工大學(xué)Dr.Joahim Vater惠贈(zèng)的菌株A1/3、b213、Cl為標(biāo)準(zhǔn)菌株.分析結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌菌株一般出現(xiàn)3-4條譜帶，其中m/z為379、493、618、714、843和969是經(jīng)常和比較穩(wěn)定出現(xiàn)的特征性信號(hào)譜帶. 我們對(duì)上述鑒定的枯草芽孢桿菌進(jìn)行了油菜菌核病菌和水稻白葉枯病菌的平板抑菌實(shí)驗(yàn).結(jié)果表明，菌株B3、38、43、49、55和85對(duì)油菜菌核病菌具有顯著的

5、抑制菌絲生長(zhǎng)的作用，MALDI-TOF檢測(cè)表明，這些菌株能夠產(chǎn)生抑制真菌的脂肽化合物fengycin和iturin family(Bacillomycins D、Iturin和Mycosubtilins).而38、43、55和85還對(duì)水稻白葉枯病菌具有顯著抑制作用，可以用這些菌株能夠產(chǎn)生具有抑制細(xì)菌活性的脂肽化合物surfactin來(lái)解釋. 為了提高枯草芽孢桿菌脂肽活性物質(zhì)的產(chǎn)量，對(duì)脂肽化合物合成調(diào)控區(qū)的兩個(gè)未知功能的基因ycx

6、D和aspB3進(jìn)行了初步的研究?？莶菅挎邨U菌存在十多種GntR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控子，參與細(xì)菌中各種不同的生物過(guò)程的調(diào)控?；蚬δ茴A(yù)測(cè)表明，ycxD基因編碼產(chǎn)物屬于GntR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控子，并具有轉(zhuǎn)氨酶的結(jié)構(gòu)域。AspAT轉(zhuǎn)氨酶編碼基因也有十多個(gè)，這類酶對(duì)枯草芽孢桿菌氮和碳代謝起到非常重要的作用?；蚬δ茴A(yù)測(cè)表明，aspB3基因編碼產(chǎn)物具有天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的功能域。為了驗(yàn)證這兩個(gè)基因編碼產(chǎn)物是否具有轉(zhuǎn)氨酶的活性，本研究分別構(gòu)建了大腸桿菌表達(dá)載體pE

7、TycxD和pETasp，并利用Ni柱純化重組蛋白.轉(zhuǎn)氨酶活性研究表明，YcxD蛋白不具有轉(zhuǎn)氨酶的功能，推YcxD蛋白可能屬于GntR轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族，具體的功能有待進(jìn)一步深入研究.酶活性檢測(cè)表明，AspB3蛋白屬于天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶家族。對(duì)AspB3蛋白的酶學(xué)性質(zhì)深入研究表明，AspB3轉(zhuǎn)氨酶的最適反應(yīng)溫度為40℃，最適PH值為8.2，最適底物為L(zhǎng)-Asp.該酶的熱穩(wěn)定性強(qiáng)，并且金屬離子對(duì)酶反應(yīng)有影響。AspB3蛋白的序列分析和系統(tǒng)發(fā)育研

8、究表明AspB3轉(zhuǎn)氨酶是新型的熱穩(wěn)定性天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶，屬于AspAT家族的Iα亞家族.催化活性位點(diǎn)的研究表明: AspB3蛋白中D232殘基的功能是固定輔酶，加強(qiáng)輔酶的吸電子能力和加速反應(yīng)的活性；K270殘基是輔酶PLP的結(jié)合部位；R403殘基直接參與二羧基底物識(shí)別，目前，E.coli AspAT被應(yīng)用于酶法生產(chǎn)氨基酸.例如，生成的L-苯丙氨酸(L-Phe)，但E.coli AspAT的熱穩(wěn)定性不強(qiáng)制約著這種酶法生產(chǎn)氨基酸的大規(guī)模應(yīng)用，

9、相比之下AspB3轉(zhuǎn)氨酶具有熱穩(wěn)定性強(qiáng)、酶活性高，最適溫度偏堿的優(yōu)勢(shì)，因此AspB3轉(zhuǎn)氨酶具有應(yīng)用生產(chǎn)L-Phe的價(jià)值. 為了向枯草芽孢桿菌中引入新的生防作用因子，本研究利用芽孢桿菌分泌表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建了能分泌HpaGXooc蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌.HpaGXooc是由水稻細(xì)條斑菌(Xanthornonas oryzae pv. oryzicola)產(chǎn)生的一種非特異性蛋白激發(fā)子，屬于harpin蛋白家族.HpaGXooc能激

10、發(fā)非寄主植物的過(guò)敏性壞死，誘導(dǎo)植物抗蟲、抗病和抗旱，而且能促進(jìn)植物生長(zhǎng)，在本研究中，為了利用芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)分泌表達(dá)HpaGXooc，構(gòu)建了pMSF、pM43SF和pM43HF三個(gè)表達(dá)載體.pMSF重組載體含有HpaII組成性啟動(dòng)子和nprB信號(hào)肽組件；pM43SF和pM43HF兩個(gè)重組載體都含有P43強(qiáng)啟動(dòng)子和nprB信號(hào)肽組件，不同的是為了快速地純化分泌的重組蛋白，pM43HF分泌的HpaGXooc的C端融合了6×His tag標(biāo)簽

11、.SDS-PAGE和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明芽孢桿菌能夠分泌表達(dá)HpaGXooc蛋白.ELISA分析結(jié)果表明，B.subtilis WBSF1(pMSF)的HpaGXooc表達(dá)量低于B.subtilis WBSF2(pM43SF)和B.subtilis WBHF(pM43HF)，該實(shí)驗(yàn)證明了在芽孢桿菌中HpaII啟動(dòng)子活性低于P43啟動(dòng)子.我們又將高效表達(dá)載體pM43HF轉(zhuǎn)入surfactin生產(chǎn)菌株B.subtilis O

12、KB105中，得到了基因工程菌株B.subtilisOKBHF.Western blot和ELISA檢測(cè)表明B.subtilis OKBHF的HpaGXooc表達(dá)量低于WBHF.ELISA測(cè)定了B.subtilis WBHF分泌HpaGXooc的最佳培養(yǎng)條件，B.subtilisWBHF分泌的HpaGXooc的生物學(xué)功能的測(cè)定表明：該重組蛋白能激發(fā)煙草的HR(hypersensitive response)反應(yīng)，和促進(jìn)煙草根系的生長(zhǎng).R