天目類芽孢桿菌新種所產(chǎn)脂肽類抗生素體內(nèi)外抗菌活性及抗菌機(jī)理研究.pdf

1、由多重耐藥的革蘭氏陰性桿菌，包括銅綠假單胞菌、大腸桿菌、鮑曼不動桿菌以及肺炎克雷伯菌等，引起的醫(yī)院獲得性感染在過去的十年里正逐步增多。與之相反，近些年來，實質(zhì)上卻沒有開發(fā)出一種新藥是專門針對這些多重耐藥致病菌的。正是這種不匹配的多重耐藥性的增加與抗菌藥物開發(fā)管道的衰竭，才使得美國傳染病協(xié)會將銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌以及肺炎克雷伯菌列為6種最需優(yōu)先應(yīng)對的危險多重耐藥微生物之列。目前，多粘菌素正逐漸成為治療這些對其它所有常用抗生素均耐藥的

2、革蘭氏陰性細(xì)菌所引起感染的最后一道防線。然而，盡管新的證據(jù)顯示多粘菌素的毒性沒有以往報告中所說的那么嚴(yán)重，但是其機(jī)會性毒性，特別是腎毒性常導(dǎo)致治療的復(fù)雜化甚至停藥。因此，非常有必要加快開發(fā)高效、低毒的新型多粘菌素結(jié)構(gòu)類似物或其它新藥，以應(yīng)對日益嚴(yán)重的革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥性問題。本實驗室在早期微生物資源篩選時獲得兩株疑是新種（F6-B70和B27），這兩株菌對所有測試過的致病菌，包括銅綠假單胞菌和大腸桿菌，均具有很強(qiáng)的拮抗作用。本研究主要圍

3、繞菌株F6-B70及其所產(chǎn)抗革蘭氏陰性菌活性化合物進(jìn)行研究，具體內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　 1、菌株F6-B70和B27多相分類研究根據(jù)細(xì)胞形態(tài)特征、生理生化特性、細(xì)胞壁類型、全細(xì)胞脂肪酸組成，DNA G+C mol％含量，結(jié)合16S rRNA基因序列分析、rpoB基因序列分析、及DNA-DNA同源性分析，確定菌株F6-B70和B27為同一個種，并屬于類芽孢桿菌屬中的一個新種，命名為天目類芽孢桿菌(Paenibacillus tia

4、nmuensis sp.nov)。
　　 2、菌株F6-B70脂肽類抗生素的制備和結(jié)構(gòu)鑒定利用不同發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株F6-B70，發(fā)現(xiàn)菌株F6-B70在以硫酸銨為唯一氮源的合成培養(yǎng)基KL中能產(chǎn)生顯著抗革蘭氏陰性菌活性化合物;發(fā)酵上清經(jīng)Amberlite XAD-16吸附樹脂、C18固相萃取柱及HPLC等多步分離純化，獲得五種脂肽類抗生素。經(jīng)LC-MS、MS-MS、GC-MS以及氨基酸組分分析，表明這五種活性物質(zhì)中有兩種為已知抗生

5、素pelgipeptin B和D，而另三種（octapeptin B5、B6和B7）則為新的多粘菌素B結(jié)構(gòu)類似物。其中，octapeptin B5（又名八肽菌素）的抗革蘭氏陰性菌活性最好、產(chǎn)量最高。
　　 3、八肽菌素體外抗菌活性及抗菌機(jī)理研究將革蘭氏陰性菌從標(biāo)準(zhǔn)菌株擴(kuò)大到從臨床上分離獲得的銅綠假單胞菌、大腸桿菌、克雷伯氏菌以及鮑曼不動桿菌;同時對其抗菌機(jī)理進(jìn)行研究。結(jié)果表明，八肽菌素在體外對革蘭氏陰性菌具有快速強(qiáng)力的殺菌作用，

6、包括多重耐藥和超廣譜耐藥的臨床分離菌株。其中大腸桿菌和銅綠假單胞菌對八肽菌素最為敏感，其最低抑菌濃度為2-4μg/ml，比polymyxinB(PMB)略高。八肽菌素對銅綠假單胞菌細(xì)胞外膜的破壞能力和PMB相當(dāng)，但其破壞細(xì)菌內(nèi)膜的能力卻比PMB略差。八肽菌素殺菌曲線和其對細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)膜的去極化程度緊密關(guān)聯(lián)，暗示八肽菌素可能是通過破壞細(xì)胞質(zhì)膜來殺死細(xì)菌的。
　　 4、八肽菌素急性毒性和小鼠體內(nèi)保護(hù)實驗為進(jìn)一步評估八肽菌素在臨床上的應(yīng)

7、用潛力，我們將八肽菌素制備工藝進(jìn)行放大，制備足夠樣品，并進(jìn)行體內(nèi)動物實驗。結(jié)果表明，八肽菌素靜脈單次給藥對昆明種小鼠的急性毒性LD50值為15.459 mg/kg，比PMB靜脈單次給藥對昆明種小鼠的急性毒性LD50(6.527mg/kg)高2倍多;體內(nèi)保護(hù)實驗結(jié)果表明，和PMB一樣，八肽菌素靜脈單次給藥4 mg/kg、連續(xù)3天，對大腸桿菌所致的小鼠腹膜炎具有明顯保護(hù)作用。上述結(jié)果表明八肽菌素在臨床上的應(yīng)用潛能值得進(jìn)一步研究，以應(yīng)對日益嚴(yán)