芽孢桿菌脂肽類抗生素多樣性與羅克霉素合成酶啟動子關(guān)鍵調(diào)控因子的初步研究.pdf

1、芽孢桿菌是重要的生物防治資源，能夠產(chǎn)生豐富的具有極高生物工程利用價值的脂肽類抗生素。目前芽孢桿菌研究的比較詳細(xì)的脂肽類化合物有表面活性素家簇（surfactins）、伊枯草素家簇(iturins)、泛革素家簇(fengycins)，芽孢桿菌脂肽類抗生素是抑制植物病原真菌的主要成分。
　　為了明確55株芽孢桿菌(Bacillus spp.)菌株對3個植物病原真菌（小麥紋枯病菌Rhizoctonia cerealis、小麥赤霉病菌Fu

2、sarium graminearum、西瓜枯萎病菌Fusariumoxysporum f.sp.niveum）抑菌活性及與其產(chǎn)生的脂肽類抗生素種類的定性定量關(guān)系，本文采用平板對峙培養(yǎng)法、PCR擴(kuò)增脂肽類抗生素合成相關(guān)基因、質(zhì)譜及液相色譜分析方法。結(jié)果表明芽孢桿菌脂肽類抗生素是抑制植物病原真菌的主要成分，芽孢桿菌產(chǎn)生的3大家簇脂肽類抗生素中fengycins和surfactins種類單一，iturins類型多樣。55株芽孢桿菌基因組PCR

3、擴(kuò)增結(jié)果與質(zhì)譜檢測結(jié)果表明，73％三種抗生素基因擴(kuò)增結(jié)果與質(zhì)譜檢測結(jié)果一致，27％結(jié)果不相符。根據(jù)iturins的色譜峰出峰時間及峰型分為4大類，發(fā)現(xiàn)iturins結(jié)構(gòu)類型及分泌量與芽孢桿菌抗真菌活性密切相關(guān)。根據(jù)對質(zhì)譜峰質(zhì)量的推測發(fā)現(xiàn)了2種未知的脂肽類物質(zhì)，對其結(jié)構(gòu)及生物活性需要進(jìn)一步探索。
　　為進(jìn)一步分析三種脂肽類抗生素對植物病原真菌的抑菌作用，我們挑選了一株代表菌株解淀粉芽孢桿菌B1619（Bacillus amyloli

4、quefaciens）進(jìn)行三種脂肽類抗生素的分離及鑒定。生防菌株B1619能有效防控番茄枯萎病的發(fā)生和為害，本實(shí)驗(yàn)從該菌株發(fā)酵液上清中分離脂肽類抗生素。利用鹽酸沉淀、甲醇抽提法等方法、選取SupelcleanTM LC-18柱及PHASE HF-NH2柱對三種脂肽類抗生素粗提物進(jìn)行分離;利用PCR技術(shù)、MALDI-TOF-MS和HPLC分析、鑒定三種脂肽類抗生素;采用平板對峙培養(yǎng)分別測定三種脂肽類抗生素粗提物對番茄枯萎病菌(Fusari

5、um oxysporumf.sp.lycopersici)的抑菌活性。通過分析發(fā)現(xiàn)，分別在60％、70％和100％甲醇洗脫液中分離到bacillomycinL、fengycins和surfactins。平板對峙法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明bacillomycinL和fengycins對番茄枯萎病菌有較強(qiáng)的抑菌效果，surfactins的抑菌活性較弱。B1619菌株分泌三種脂肽類抗生素，其中對番茄枯萎病菌生長抑制中起重要作用的抗生素是bacillomy

6、cinL和fengycins。
　　枯草芽孢桿菌是生防模式菌株，羅克霉素(locillomycin)是在枯草芽孢桿菌Bs916中發(fā)現(xiàn)的一種新的脂肽類抗生素，其啟動子ploc受到多種蛋白調(diào)控因子的作用。克隆報(bào)告基因極耐熱木聚糖酶基因xynB(GenBank登錄號:AY340789)，將其與羅克霉素啟動子融合，構(gòu)建融合質(zhì)粒載體pXYNB2，將其轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌Bs916中，獲得重組枯草芽孢桿菌(Bs916/pXYNB2)。對ploc

7、啟動子區(qū)域進(jìn)行不同長度的截短，探究多個蛋白調(diào)控因子對ploc啟動子轉(zhuǎn)錄水平的影響。比較重組菌(Bs916/pXYNB2)、15個截短基因重組菌(Bs916/ΔpXYNB2)和對照菌株(Bs916/pRP22)之間報(bào)告基因木聚糖酶活的差異，結(jié)果顯示，當(dāng)逐一切除1 resD及9 hpr，重組菌Δ1 resD及Δ9 hpr木聚糖酶活下降較明顯，推測這兩個蛋白調(diào)控因子在ploc啟動子中起非常關(guān)鍵的正調(diào)控作用;而切除2 spoⅢD及8spoAⅡ兩