芽孢桿菌抗菌脂肽分離純化及Bacillomycin D抑制黃曲霉作用的研究.pdf

1、抗菌脂肽是由芽孢桿菌屬通過非核糖體途徑合成的的具有抗細菌、真菌、病毒和支原體功能的脂肽類化合物。此外，脂肽還具有很強的表面活性。因此，抗菌脂肽在食品、化妝品、生物防治、生物醫(yī)藥以及石油工業(yè)、生物修復(fù)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。
　　 為了對脂肽進行更深入、更廣泛的研究，需要建立各種脂肽純品的制備方法，為進一步的應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。本研究建立了surfactin、fengycin的制備方法;利用制備的fengycin純品在高

2、效液相色譜上建立了fengycin的檢測方法;對fmbj菌株中抑制黃曲霉的活性物質(zhì)進行了分離鑒定并建立了其制備的方法，對其抑制黃曲霉的作用進行了研究，主要研究結(jié)果如下:
　　 1.建立了surfactin純品的制備方法。通過酸沉淀、有機溶劑抽提、柱層析、制備色譜建立了surfactin的制備方法，經(jīng)抑菌實驗、溶血實驗以及液相檢測保留時間與surfactin標(biāo)品的保留時間對比知，此方法簡單有效。
　　 2.建立了fengy

3、cin純品的制備方法并在HPLC上建立了fengycin的檢測方法。通過酸沉淀、有機溶劑提取、柱層析、制備色譜、冷凍干燥建立了從Bacillusamyloliquefaciens ES-2-4發(fā)酵液中制備fengycin的方法，經(jīng)抑菌實驗、HPLC分析、LC-MS以及MS-MS分析知fengycin的純度較高。利用制備的fengycin純品，建立了一種用高效液相色譜測定發(fā)酵液中fengycin含量的新方法。該方法采用色譜柱為Agilen

4、t C18柱，4.6 mm×250 mm×0.5μm色譜柱，以乙腈（含0.1％三氟乙酸）和水（含0.1％三氟乙酸）為流動相，流速0.6 mL/min梯度洗脫，205 nm紫外(DAD)檢測。結(jié)果表明:運用本方法在5-1000 mg/L范圍內(nèi)fengycin濃度與積分面積之間具良好的相關(guān)性(r=0.9997)，精密度為1.7673％，檢出限5 mg/L。
　　 3.對Bacillus subtilis fmbj中抑制黃曲霉的活性物

5、質(zhì)進行了分離鑒定。通過酸沉淀、有機溶劑提取、Sephadex LH-20柱層析和制備型HPLC等一系列分離純化步驟，從枯草芽孢桿菌fmbJ的發(fā)酵液中分離純化得到對黃曲霉有抑制作用的1-6號活性峰。經(jīng)LC-MS分析知fmbj發(fā)酵液中對黃曲霉有抑制作用的物質(zhì)是分子量為1030、1044、1058、1072的Bacillomycin D的4種同系物。在制備色譜上建立了Bacillomycin D純品的制備方法，通過抑菌譜實驗發(fā)現(xiàn)Bacillo

6、mycin D對各種霉菌均有很強的抑制作用。
　　 4.利用制備的Bacillomycin D純品，對其抑制黃曲霉的作用進行了研究。Bacillomycin D對黃曲霉病菌的菌絲生長、孢子萌發(fā)和產(chǎn)孢能力都具有明顯的抑制作用。對黃曲霉病菌孢子的最小抑菌濃度(MIC)為Bacillomycin D0.05 mg/mL，最小致死濃度(MFC)為Bacillomycin D0.2 mg/mL。通過掃描電鏡和透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn):Bacill