人類PIF1解螺旋酶的功能研究.pdf

1、目的:PIF1基因被普遍認(rèn)為是輻射敏感型的基因,通過研究PIF1基因參與電離輻射誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù),來探討PIF1基因參與DNA損傷修復(fù)的分子機(jī)制。利用RNA干擾技術(shù)“敲低”PIF1全長(zhǎng)基因,進(jìn)一步的研究PIF1解螺旋酶的生理功能。構(gòu)建三種重組質(zhì)粒,用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其分別轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中來篩壓穩(wěn)轉(zhuǎn)過表達(dá)的細(xì)胞系,用于對(duì)PIF1基因的更深入的研究。
　　方法:對(duì)培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞進(jìn)行不同劑量的γ射線照射,用Western bl

2、ot和Real-Time PCR來檢測(cè)PIF1基因的表達(dá)量的變化,從變化中來了解和研究PIF1基因在DNA損傷修復(fù)中可能存在的功能。利用RNA干擾技術(shù)“沉默”PIF1全長(zhǎng)基因,通過Western blot和Real-Time PCR來檢測(cè)敲低細(xì)胞PIF1基因的敲低效果。觀察敲低的細(xì)胞系與野生型細(xì)胞系在生長(zhǎng)狀態(tài)上的差異.對(duì)敲低的細(xì)胞系進(jìn)行不同劑量的γ射線照射,通過活細(xì)胞計(jì)數(shù)了解細(xì)胞的增殖能力,流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞周期,克隆形成率等實(shí)驗(yàn)來觀察敲

3、低細(xì)胞株與野生型細(xì)胞株在γ射線照射前后細(xì)胞的生存能力、DNA損傷修復(fù)情況及細(xì)胞周期變化情況。從pCR2.1-TOPO-PIF1原始質(zhì)粒中,利用PCR方法擴(kuò)增目的基因PIF1、PIF1N及PIF1C,將目的基因和目的載體pcDNA3.1(-)分別酶切定向連接,構(gòu)建出三種重組質(zhì)?！綪cDNA3.1(-)-PIF1、PcDNA3.1(-)-PIF1N、PcDNA3.1(-)-PIF1C】。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將這三種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞

4、中,篩壓穩(wěn)轉(zhuǎn)過表達(dá)的細(xì)胞系。
　　結(jié)果:1.HeLa細(xì)胞經(jīng)不同劑量的γ射線處理后通過Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PIF1蛋白表達(dá)量在不同時(shí)間點(diǎn)有先降低后升高的趨勢(shì),用Real-Time PCR的方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PIF1基因在mRNA水平上也出現(xiàn)不同時(shí)間點(diǎn)有先降低后升高的趨勢(shì)。
　　2.通過Western blot和Real-Time PCR的方法檢測(cè)出敲低的細(xì)胞系與對(duì)照細(xì)胞相比較在轉(zhuǎn)錄與翻譯水平上都有不同程度的敲低現(xiàn)象。對(duì)敲

5、低的細(xì)胞系進(jìn)行不同劑量的γ射線照射處理后,活細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)Sh-PIF1-Hela敲低細(xì)胞比Sh-NC-Hela對(duì)照細(xì)胞的生長(zhǎng)速度要慢很多且細(xì)胞凋亡增加?？寺⌒纬陕蕦?shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著細(xì)胞照射劑量的增加,細(xì)胞的增殖能力降低,形成克隆數(shù)減少,敲低細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞相比,細(xì)胞的生存能力降低。流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)敲低細(xì)胞G2/M期阻滯明顯延長(zhǎng)。
　　3.成功構(gòu)建出三種重組質(zhì)粒,并對(duì)其轉(zhuǎn)染的三種過表達(dá)的細(xì)胞系,通過Western blot法并沒有檢

6、測(cè)出PIF1蛋白表達(dá)量的升高,但用Real-Time PCR的方法測(cè)出PcDNA3.1-PIF1全長(zhǎng)和PcDNA3.1-PIF1C端的mRNA相對(duì)表達(dá)量都有一定程度的增加,而PcDNA3.1-PIF1N端的mRNA的相對(duì)表達(dá)量并沒有增加。是否構(gòu)建出穩(wěn)轉(zhuǎn)的細(xì)胞系有賴于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
　　結(jié)論:1.PIF1基因具有輻射敏感性,與DNA損傷修復(fù)相關(guān)。
　　2.成功的構(gòu)建出穩(wěn)轉(zhuǎn)敲低的細(xì)胞系(Sh-PIF1-Hela)。發(fā)現(xiàn)PIF