小麥漸滲系SR4堿脅迫應答基因TaCCD1和TaStpk-B的功能研究.pdf

1、植物所受到的堿脅迫是由土壤中的Na2CO3和NaHCO3所造成的。與鹽脅迫相比，植物受到的堿脅迫的損傷程度更為嚴重。這是因為堿脅迫除了離子和滲透脅迫，還包含高pH脅迫。至今，人們在植物耐鹽機制研究方面較為廣泛而深入，但是對植物的堿脅迫響應機制卻研究較少，亟待加強。
　　山融4號（Shanrong No.4簡稱SR4）是本實驗室利用不對稱體細胞雜交技術將長穗偃麥草的染色質漸滲到普通小麥濟南177中獲得的小麥耐鹽堿新品系。前期通過大田

2、及鹽堿池種植實驗均證明SR4具有很強的抗堿特性并且利用第二代轉錄組測序技術分析小麥山融4號根系堿脅迫響應基因，從中篩選出TaCCD1和TaStpk-B進行功能鑒定。
　　1.SR4鈣離子結合蛋白TaCCD1的功能研究
　　我們以SR4的cDNA為模板克隆到了一個約600 bp的TaCCD1的開放閱讀框。它編碼一種含有EF手型基序motif的鈣離子結合蛋白。亞細胞定位實驗表明:TaCCD1定位于細胞核和細胞質。qRT-PCR分

3、析實驗表明，TaCCD1在不同的脅迫處理條件下表現出不同的表達模式。通過浸花法將TaCCD1轉入野生型擬南芥，篩選出兩個表達量較高的TaCCD1過表達純系進行耐逆相關研究。在堿脅迫處理條件下，TaCCD1 OE系的根較對照Col-0長，表明TaCCD1OE系對于堿脅迫具有抗性。之后的堿脅迫處理萌發(fā)實驗表明TaCCD1 OE系的子葉綠化程度較Col-0高，表現出對堿脅迫的抗性。葉綠素含量測定結果證明:在經堿pH處理之后，野生型植株的葉綠素

4、含量低于過表達植株。上述實驗均證明TaCCD1可以促進植物對于堿脅迫的抗性。在ABA脅迫處理條件下，TaCCD1 OE的根較Col-0長，表明TaCCD1增強了植物對于ABA的抗性。在鹽脅迫處理條件下，TaCCD1 OE的根較Col-0長，表明TaCCD1增強了植物對于鹽脅迫的抗性。在H2O2脅迫處理條件下，TaCCD1 OE的側根數目較Col-0多，表明TaCCD1增強了植物對于氧化脅迫的抗性。TaCCD1 OE系體內的ROS含量較C

5、ol-0低，且TaCCD1 OE系有較高水平的ROS清除酶活性。進一步分析，證實了依賴ABA的脅迫應答基因MYB2、RAB18、RD29B在TaCCD1 OE系中有所上調，ABA信號通路的正調控因子ABI5表達量下調;而不依賴ABA的脅迫應答基因DREB2A表達量上調。離子轉運載體相關基因SOS2和HKT表達量上調。在堿處理條件下，葉綠素合成相關的基因HEMF2，HEME2，HEMB2，HEME1，CRD1，GSA1，PORA，PORB

6、較Col-0出現上調表達，而葉綠素分解基因SGR沒有明顯變化。綜上所述，TaCCD1可以通過調控ROS的積累及鈉離子的轉運促進植物對堿脅迫、鹽脅迫和氧化脅迫等非生物脅迫的抗性，且這些抗性可能是通過調控ABA信號通路來起作用的。此外，TaCCD1通過正調控葉綠素合成基因的表達賦予過表達植株堿抗性。
　　2.耐鹽堿小麥漸滲系SR4 TaStpk-B的研究
　　我們從SR4中克隆到了一個約1.2 kb的TaStpk-B的開放閱讀框

7、。TaStpk-B編碼的產物是含有Ser/Thr保守結構域的蛋白質。亞細胞定位實驗表明:TaStpk-B定位于細胞質中。qRT-PCR分析實驗表明，該基因在不同的脅迫處理條件下表現出不一樣的表達模式。通過浸花法將TaStpk-B轉入野生型擬南芥，篩選出兩個表達量較高的TaStpk-B過表達純系進行耐逆相關研究。在堿脅迫處理條件下，TaStpk-B OE系的根較對照Col-0長，表明TaStpk-B OE系對于堿脅迫具有抗性。在NaCl及

8、甘露醇脅迫處理條件下，TaStpk-B OE系的根較Col-0短，表明TaStpk-BOE系植株對于NaCl及甘露醇敏感。TaStpk-B OE系體內的ROS含量較Col-0低，且TaStpk-B OE系有較高水平的ROS清除酶活性。TaStpk-B OE體內離子轉運載體類基因在TaStpk-B OE和對照植物中沒有明顯差別。在鹽處理條件下，過表達系的滲透調節(jié)物質脯氨酸較野生型低。TaStpk-B使得ABA合成的關鍵基因ABA2顯著上調

9、表達，依賴于ABA信號通路的調控因子ABI3，ABI4顯著下調表達，不依賴于ABA信號通路的Marker基因RD29A顯著下調表達。綜上所述，TaStpk-B可以通過調控ROS的積累來應對植物所遭受到的堿脅迫，且過表達植物所獲得的堿脅迫抗性可能是通過促進正調控ABA合成途徑以及負調控ABA信號通路的負調控因子來起作用的。而TaStpk-B反向控制不依賴于ABA信號通路的脅迫響應RD29A，從而給予過表達植株的鹽敏感以及滲透敏感性。此外，