南極大磷蝦(Euphausia superba)胰蛋白酶適冷性酶學(xué)性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特征分析.pdf

1、南極大磷蝦（Euphausia superba）是一種常年生活在極寒地帶的甲殼動(dòng)物，在進(jìn)化過(guò)程中形成了一系列適應(yīng)寒冷環(huán)境的機(jī)制，而胰蛋白酶作為催化生物體內(nèi)代謝反應(yīng)的主要物質(zhì)在這種機(jī)制中又起到了關(guān)鍵作用。目前，已經(jīng)有一些從其它動(dòng)物體內(nèi)提取的適冷酶的相關(guān)研究相繼被報(bào)道。本文主要從酶學(xué)性質(zhì)、熒光光譜及分子特征等方面對(duì)南極大磷蝦（Euphausia superba）胰蛋白酶進(jìn)行了研究，目的是為其作為功能物質(zhì)的應(yīng)用和開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。
　　

2、本研究共分以下三個(gè)部分：
　　第一部分：南極磷大磷蝦胰蛋白酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究。
　　以南極大磷蝦頭為材料經(jīng)過(guò)粗提、DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析和 Sephacryl S100凝膠過(guò)濾層析后，獲得了三種酶，分別命名為 S100-Ⅰ、DEAE-Ⅱ和DEAE-Ⅲ，其純化倍數(shù)分別為7.463倍、11.483倍和12.086倍；經(jīng)過(guò)SDS-PAGE，測(cè)得三種酶的分子量分別是27.16 kDa、2

3、6.71kDa和26.82 kDa；三種酶的最適酶活溫度分別為40℃、45℃和40℃，并且隨著溫度的增加，酶活性逐漸降低；三種酶的低溫穩(wěn)定性均較好（25℃以下，12h內(nèi)仍能保持85％以上的相對(duì)酶活性），35℃時(shí)，S100-Ⅰ的穩(wěn)定性相對(duì)較弱，而在40~45℃之間，酶DEAE-Ⅱ表現(xiàn)出更好的溫度穩(wěn)定性；三種酶的催化效率（14.28,9.46,5.93）比牛胰蛋白酶（3.59）分別高4.0、2.6倍和1.7倍。
　　第二部分：南極大磷

4、蝦胰蛋白酶的內(nèi)源熒光光譜及苯甲脒對(duì)其熒光淬滅作用的研究。
　　對(duì)三種酶進(jìn)行內(nèi)源熒光掃描，結(jié)果表明，三種酶S100-Ⅰ、DEAE-Ⅱ和DEAE-Ⅲ的熒光峰位都在345nm附近，并且都存在能量由Tyr無(wú)輻射的向Trp的轉(zhuǎn)移；隨著溫度的增加，三種酶的熒光強(qiáng)度均呈現(xiàn)出規(guī)律性的降低。胰蛋白酶的特異性抑制劑苯甲脒對(duì)酶DEAE-Ⅲ的熒光淬滅最弱，DEAE-Ⅱ次之，S100-Ⅰ最強(qiáng)，并且隨著苯甲脒濃度的增加，三種酶的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)有規(guī)律的降低。苯甲

5、脒對(duì)酶S100-Ⅰ和DEAE-Ⅱ的淬滅屬于靜態(tài)淬滅，其與二者之間存在一系列相對(duì)獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)，強(qiáng)烈的相互作用最終使二者之間形成了復(fù)合物；而對(duì)酶DEAE-Ⅲ的淬滅則是動(dòng)態(tài)和靜態(tài)共同作用的結(jié)果。熱力學(xué)參數(shù)的研究結(jié)果顯示，相比之下，酶S100-Ⅰ的自由能變化（⊿G）最低而焓變化（⊿H）及熵變化（⊿S）最高，表明其催化活性最強(qiáng)，柔性最弱而溫度的穩(wěn)定性也最差，而酶 DEAE-Ⅲ的結(jié)果剛好相反，酶DEAE-Ⅱ居中。
　　第三部分：南極大磷蝦分

6、子結(jié)構(gòu)特征分析。
　　提取南極大磷蝦胰蛋白酶總RNA，克隆獲得cDNA并分析cDNA基因及蛋白序列,比對(duì)不同種類動(dòng)物胰蛋白酶序列。結(jié)果表明，動(dòng)物胰蛋白酶氨基酸數(shù)目隨著進(jìn)化逐漸減小，不同類群有各自含量較多的氨基酸類型。甲殼動(dòng)物胰蛋白酶分子直徑較小，結(jié)構(gòu)單一，但是酶功能多樣；脊椎動(dòng)物胰蛋白酶分子直徑較甲殼動(dòng)物的增大，結(jié)構(gòu)多樣性較多，但酶功能趨于單一。由于外周和活性中心部位附近精氨酸、賴氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、組氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、