基于簡化氨基酸的肌激酶表達(dá)、純化、結(jié)晶與初步功能研究.pdf

1、蛋白質(zhì)的起源機(jī)制是生命起源研究最有挑戰(zhàn)性的問題之一。基于小分子配體的保守性，我們實驗室提出蛋白質(zhì)起源的小分子誘導(dǎo)、選擇模型，認(rèn)為最早產(chǎn)生的蛋白質(zhì)是ATP等小分子誘導(dǎo)和選擇的結(jié)果。為了對該模型進(jìn)行實驗驗證，采用“自上而下（Top-Down）”的策略，設(shè)計完全由存在于原始環(huán)境中的簡化氨基酸組成的蛋白序列，并對理論設(shè)計的蛋白序列進(jìn)行表達(dá)、純化、結(jié)晶。我們選取大腸桿菌肌激酶的序列為模板，前期已完成氨基酸的簡化，并得到了新的序列，本文針對這一理論

2、設(shè)計的蛋白進(jìn)行了表達(dá)、純化、結(jié)晶和初步的功能研究，主要結(jié)果如下：
　　（1）利用分子克隆技術(shù)，構(gòu)建融合表達(dá)載體。將設(shè)計的氨基酸序列轉(zhuǎn)化為核苷酸序列，添加Nde I/Xho I為酶切位點(diǎn)，優(yōu)化密碼子后人工合成全長的基因375bp，并將這段基因克隆到載體pET28b上，構(gòu)建表達(dá)載體pET28b-cAK，導(dǎo)入大腸桿菌BL21（DE3）菌株中。
　?。?）目的蛋白表達(dá)和純化。對構(gòu)建成功的表達(dá)載體，從誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度、誘導(dǎo)時間等

3、方面進(jìn)行了條件優(yōu)化，而且進(jìn)行了高效自誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果表明：目的蛋白（命名為 cAK）可以進(jìn)行可溶性表達(dá)，而且表達(dá)量很高，自誘導(dǎo)表達(dá)的目標(biāo)蛋白質(zhì)的量是普通誘導(dǎo)表達(dá)的8-10倍。對融合蛋白進(jìn)行了兩步IMAC純化，Thrombin酶切，獲得了高純度的cAK蛋白。
　　（3）cAK結(jié)晶條件的篩選。我們對cAK自由態(tài)以及與小分子形成的復(fù)合態(tài)分別進(jìn)行了結(jié)晶條件的初步篩選，獲得了三個結(jié)晶條件，為后續(xù)結(jié)構(gòu)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　（4）初步探討了