硫化物應(yīng)激下單環(huán)刺螠MAPK信號通路的功能初探.pdf

1、JNK、p38和ERK是MAPK信號通路中三條主要亞通路的關(guān)鍵分子，在生物體內(nèi)參與多種生命進程，如細胞增殖、分化、黏附、存活、死亡、代謝以及應(yīng)對多種環(huán)境應(yīng)激等。目前大多數(shù)的相關(guān)研究都聚焦于哺乳動物，并且在體外培養(yǎng)細胞中開展研究。海洋無脊椎動物種類繁多，具有多樣的生理特征和生存環(huán)境，開展MAPK通路在低等動物中的相關(guān)研究，將有助于人們系統(tǒng)認知這些通路的生物學(xué)功能以及闡述其在動物適應(yīng)環(huán)境中的作用。單環(huán)刺蜢（Urechis unicinctu

2、s）是一種棲息于沿岸底質(zhì)“U”形管道內(nèi)的蜢蟲動物，在退潮期間其洞穴內(nèi)的硫化物濃度通常明顯提高。之前的研究表明單環(huán)刺螠可以耐受這種硫化物的暴露，并且已在細胞學(xué)特征、代謝產(chǎn)物以及關(guān)鍵酶的作用等方面對這種現(xiàn)象進行了解析。本文定位于MAPK信號通路，嘗試研究其在單環(huán)刺螠耐受硫化物過程中的作用，以期確定單環(huán)刺螠組織細胞中參與應(yīng)對硫化物的關(guān)鍵MAPK亞通路，為揭示單環(huán)刺螠耐受硫化物的分子機制提供科學(xué)數(shù)據(jù)。本研究取得的主要結(jié)果如下:
　　采用R

3、ACE技術(shù)獲得了單環(huán)刺螠MAPK通路3個亞通路中的關(guān)鍵分子JNK、p38和ERK的cDNA序列，其中JNK cDNA序列全長為2102 bp，編碼403個氨基酸;p38 cDNA序列全長為2772 bp，編碼363個氨基酸;ERK cDNA部分序列長度為507 bp，可編碼169個氨基酸。將JNK、p38的ORF（開放閱讀框，openreading frame）全長序列與pET28a載體連接構(gòu)建重組表達質(zhì)粒，體外成功表達了包涵體形式的J

4、NK、p38重組蛋白并獲得純度大于85％的純化蛋白，制備了它們的多克隆抗體。
　　使用本次獲得JNK、p38多克隆抗體以及商業(yè)購買的ERK多克隆體和3種蛋白的磷酸化單克隆抗體，采用Western blot技術(shù)研究了單環(huán)刺螠暴露在50μM和150μM硫化物環(huán)境下，其呼吸腸細胞中上述3個關(guān)鍵分子總蛋白（非磷酸化蛋白，未活化型蛋白）含量和磷酸化蛋白（活化型蛋白）含量的變化，結(jié)果顯示:當單環(huán)刺蜢暴露于硫化物環(huán)境中時，其呼吸腸細胞中磷酸化J

5、NK的含量呈現(xiàn)顯著性地持續(xù)升高趨勢，其起始顯著升高發(fā)生在單環(huán)刺螠暴露0.5 h，隨著暴露時間的延長，磷酸化JNK的含量持續(xù)升高，并在150μM硫化物暴露48 h時其含量增至最高，為對照組的10.2倍;此外，暴露于50μM硫化物中的單環(huán)刺螠呼吸腸磷酸化JNK含量普遍低于150μM硫化物相同暴露時間的磷酸化JNK的含量。單環(huán)刺蜢呼吸腸中磷酸化ERK的含量在硫化物暴露0.25 h～1 h期間呈現(xiàn)瞬時顯著增高的特點，之后其表達量與對照組以及不同

6、濃度硫化物組間均無顯著性差異;單環(huán)刺蜢呼吸腸中磷酸化p38的含量在整個硫化物暴露期間未見顯著性變化。單環(huán)刺蜢硫化物暴露期間，JNK、p38在呼吸腸中的總蛋白含量均未見顯著性變化，除了p38總蛋白含量在暴露后0.25 h時顯著升高;ERK的總蛋白水平在150μM硫化物處理下呈現(xiàn)先降低后恢復(fù)原水平的變化，而在50μM硫化物處理組中則持續(xù)降低至原水平的35％后維持穩(wěn)定狀態(tài)。
　　本研究結(jié)果表明，在MAPK通路的3個子通路中，JNK信號通