產(chǎn)β-mannanase內(nèi)生菌的誘變育種和酶學(xué)特性研究.pdf

1、β-甘露聚糖酶(β-mannanase)又叫β-1，4-D-甘露聚糖酶(β-1，4-D-mannan mannanohydrolase，EC3.2.1.78)，是一種半纖維素酶，能夠隨機(jī)水解β-1，4-甘露糖苷鍵的內(nèi)切水解酶。允經(jīng)被廣泛應(yīng)用于造紙、食品、飼料、紡織、印刷、石油開采及洗滌行業(yè)等諸多領(lǐng)域，成為一種極其重要的工業(yè)酶制劑。但就我國而言，由于受高成本和低產(chǎn)量的限制，β-甘露聚糖酶的研究大部分仍然處于實(shí)驗(yàn)室階段，無法大批量、大規(guī)模生

2、產(chǎn)，因此選育高產(chǎn)β-甘露聚糖酶菌株成了本研究努力的方向。
　　本實(shí)驗(yàn)從篩選的一株產(chǎn)β-甘露聚糖酶的黃豆內(nèi)生菌Bacill subtilis HD-1出發(fā)，比較了紫外線誘變，硫酸二乙酯誘變，紫外線-光復(fù)活誘變以及紫外線-硫酸二乙酯復(fù)合誘變，確定最佳誘變方案為紫外線-硫酸二乙酯復(fù)合誘變：先用20W紫外燈于30cm出照射6 min，再用1.6％的硫酸二乙酯處理40min。獲得一株高產(chǎn)突變菌株Bacillus subtilis UD-20

3、，發(fā)酵酶活達(dá)89.5U/ml，比出發(fā)菌株提高了63.9％，傳代7次其遺傳性能穩(wěn)定，命名為Bacillus subtilis UD-20。
　　通過對Bacillus subtilis UD-20的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化，確定最佳產(chǎn)酶條件為：魔芋精粉30g/L，蛋白胨3g/L，硝酸銨3g/L，氯化鈣3.0mmol/L，氯化鎂2.0mmol/L，氯化鋇0.2mmol/L，吐溫801.0g/L，甘氨酸0.2g/L(于發(fā)酵進(jìn)行10h左右

4、向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加)，2％的接種量，pH7.0，35℃，180r/min發(fā)酵培養(yǎng)72h，DNS法測得酶活最高為213.6U/ml。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行搖瓶補(bǔ)料發(fā)酵，酶活高達(dá)275.1U/ml，較未補(bǔ)料酶活提高了34％，是出發(fā)菌株的5.0倍，另外，靜置培養(yǎng)酶活也比常規(guī)發(fā)酵提高了24.5％。
　　β-甘露聚糖酶酶學(xué)特性分析顯示，該酶的最適溫度和pH分別為50℃和7.0，該酶在50℃以下，pH5.0-8.0之間穩(wěn)定性較好。2.0mmol/L的

5、鈣、鎂、鐵、鈷離子和0.2mmol/L的鉀、鈣、銅、鎳離子對酶有激活作用，其中以2.0mmol/L的鐵和鈷離子的激活作用最強(qiáng)，相對酶活分別提高了13.2％和31.7％，但是2mmol/L的錳離子對酶活有極強(qiáng)的抑制作用，酶活僅有對照組的55.6％；2.0mmol/L的鉀、鈣、鎳、鈷、鋇離子和0.2mmol/L的鎳離子能夠增強(qiáng)酶熱穩(wěn)定性，其中以2.0mmol/L的鈷離子的增強(qiáng)效果最為明顯，殘余酶活是對照組的1.48倍，但是在2.0mmol/

6、L的錳離子作用下，殘余酶活力僅有對照組的59.4％。
　　β-甘露聚糖酶對葡甘露聚糖、瓜爾豆膠和槐豆膠的Km和Vmax值分別為10.9、15.6、33.4mg/ml和9960.2、526.3、769.2U/ml，較低的Km和較高的Vmax顯示β-甘露聚糖酶的最適反應(yīng)底物為葡甘露聚糖，酶解葡甘露聚糖的酶活為6116.6U/ml，是酶解槐豆膠的22.2倍，酶解瓜爾豆膠的28.2倍，酶解槐豆膠為甘露寡糖，不含單糖。植物內(nèi)生菌Bacill