纖維素降解菌地衣芽孢桿菌CMC-4的分離鑒定、誘變、產(chǎn)酶條件及酶學特性研究.pdf

1、纖維素是自然界中分布最廣的一種復雜多糖，由β-1，4-糖苷鍵以線性模式連接葡萄糖組成盡管存在大量纖維素資源可作為再生能源發(fā)揮巨大潛能，但尚未得以充分利用，同時浪費還造成了環(huán)境污染。纖維素酶是可水解纖維素內(nèi)β-1，4-糖苷鍵并釋放葡萄糖單位的一類酶，包括外切葡聚糖苷酶(EC.3.2.1.91)、內(nèi)切葡聚糖苷酶(EC.3.2.1.4)、β-葡萄糖苷酶(EC.3.2.1.21)。纖維素酶的應用往往受限于其較低催化效率和較差的酶穩(wěn)定性。由于細菌

2、具備的生長速率高、適應多種極端環(huán)境能力以及能夠提供更高協(xié)同效率的復雜糖苷水解酶體系，大量關于細菌產(chǎn)纖維素酶的研究在全球范圍內(nèi)展開。為了滿足工業(yè)應用需求，發(fā)掘新的特殊纖維素酶類正變成研究的焦點。細菌中，芽孢桿菌屬細菌由于其較高生長速率、可分解胞外酶的能力以及生物安全性能而被廣泛關注。近年來，許多研究已經(jīng)報道了對來自芽孢桿菌屬細菌纖維素酶的純化和界定，這央中包括B.brevis、 B.pumilus、B.amyoliquefaciens和B

3、acillus subtilis，但關于地衣芽孢桿菌的研究較少。
　　本研究秸稈還田土壤中初篩獲得一株高效纖維素降解菌CMC-4，根據(jù)菌株形態(tài)、理化性質及16S rDNA序列分析，初步鑒定為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。以此為出發(fā)菌株，經(jīng)亞硝酸鈉誘變獲得一株穩(wěn)定遺傳的高產(chǎn)纖維素酶突變株CMC-4-3。對CMC-4和CMC-4-3的產(chǎn)酶條件和酶學性質進行比較分析。通過DNS法測定兩者的產(chǎn)纖維素酶活力，

4、分別為95.89 U·mL-1和160.29 U·mL-1，突變菌株CMC-4-3較原始菌株CMC-4纖維素酶活力提高67.5％。微生物中胞外纖維素酶產(chǎn)量顯著受如溫度、pH、裝液量和通氣量等因素的影響。研究結果表明CMC-4和CMC-4-3的最適產(chǎn)酶溫度均為37℃，溫度過高或過低會抑制菌體生長，從而影響酶的分泌水平。CMC-4的最適產(chǎn)酶pH為7.0，而CMC-4-3為6.0。兩者最適合產(chǎn)酶碳源分別為麥芽糖和葡萄糖，均優(yōu)于羧甲基纖維素鈉，

5、這與先前研究結果并不一致。而突變前后此種表型的變化可能是因為誘變引發(fā)菌株水解二糖的能力下降。此外，CMC-4和CMC-4-3的最適產(chǎn)酶氮源均為蛋白胨，來自其他研究中的結果也證實蛋白胨可顯著促進纖維素酶的產(chǎn)生。原始和突變菌株的最適產(chǎn)酶裝液量分別為60 mL/250 mL及80 mL/250 mL，最適產(chǎn)酶接種量也未發(fā)生變化，均為2.0％。以上結果表明，與CMC-4相比，CMC-4-3一些最適產(chǎn)酶條件，如pH和碳源，發(fā)生了變化。這可能是因為

6、誘變使得纖維素酶編碼基因突變或者引發(fā)其他相關酶基因的突變造成的。影響纖維素酶降解纖維素效率的因素主要包括反應pH、溫度、激活劑和抑制劑。由CMC-4和CMC-4-3分泌的纖維素酶在20～80℃寬泛的溫度范圍保持較高活性，并在50℃時酶活力最高，研究表明在30～70℃孵育2h后，酶活力仍然維持在60％以上。對于誘變菌株CMC-4-3所產(chǎn)纖維素酶而言，80℃孵育2h后酶活仍在70％以上，但CMC-4纖維素酶則降至40％。誘變使酶活力溫度范圍

7、得以擴展，使CMC-4-3所產(chǎn)酶成為耐熱性能較高的特殊纖維素酶。CMC-4-3維持相對酶活以及保持穩(wěn)定性的能力均優(yōu)于CMC-4。這種在高溫下維持穩(wěn)定性的能力更能滿足某些纖維素水解工業(yè)過程。酶反應pH對纖維素酶活力影響程度更大，兩個菌株來源的纖維素酶均可在pH3.0～9.0范圍水解羧甲基纖維素，且在pH6.0時表現(xiàn)出最大酶活力。且在最適反應pH兩側酶仍具有較高活力，這也表明來源于這兩株菌的纖維素酶具有特殊寬泛的pH范圍。在pH4.0～7.

8、4范圍4℃孵育24 h后酶活力仍超過60％，雖然在pH5.0時穩(wěn)定性最大。芽孢桿菌屬細菌纖維素酶最有價值的特征即為它們在較寬泛的溫度和pH范圍保持活性并維持穩(wěn)定，據(jù)此，CMC-4-3有產(chǎn)生耐熱耐酸揮較大作堿的特殊纖維素酶類，因此在纖維素水解工業(yè)過程發(fā)用。本研究還發(fā)現(xiàn)Fe2+，Mg2+、Co2+和K+可以激活目標纖維素酶，而其他金屬離子均會不同程度的抑制酶活性。在所有抑制性離子中，Cu2+和Ca2+抑制水平最大，可使酶活力減少50％左右，