結核病人與健康成人外周血γδT細胞Vδ1-8亞群分布的差異.pdf

1、背景：結核病是嚴重危害人類健康的常見感染性疾病之一，但關于機體抗結核感染的免疫機制尚未完全闡明。以往研究認為，αβT細胞中CD4+和CD8+T細胞，以及巨噬細胞在抗結核免疫中發(fā)揮關鍵性作用。近年來很多研究結果證實γδT細胞在抗結核桿菌感染免疫中也發(fā)揮重要作用。γδT細胞是與αβT細胞有不同特征的獨特T細胞，許多研究表明γδT細胞在抗感染免疫、抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用，同時γδT細胞在調節(jié)特異性免疫應答、自身免疫性疾病和變態(tài)反應性疾病的發(fā)

2、生均有重要的參與作用。γδT細胞可產(chǎn)生多種細胞因子和趨化因子，在抗感染免疫，特別是在抗結核桿菌感染的早期免疫中可能發(fā)揮重要作用。γδT細胞根據(jù)δ鏈V區(qū)不同可分為8個亞群（Vδ1至Vδ8），正常人以為Vδ2亞群為主。有研究顯示，在某些疾病患者γδT細胞中Vδ1和Vδ2亞群的比例明顯改變。本研究室的前期研究中也觀察到同樣現(xiàn)象。我們關注的科學問題是：健康成年人與結核病人γδT細胞的Vδ1-8各亞群分布情況究竟是怎樣的，健康成年人與結核病人是否

3、有明顯差異？尤其是Vδ1亞群和Vδ2亞群。
　　目的：調查健康成人外周血中Vδ1-8各亞群的分布情況和結核病人外周血中Vδ1-8各亞群的分布改變，通過研究對比，探討γδT細胞Vδ1-8各亞群，特別是Vδ1亞群和Vδ2亞群在結核感染中可能發(fā)揮的不同作用。
　　方法：抽取一定數(shù)量健康成人和結核病人空腹靜脈血于肝素鈉抗凝管中備用，取試管與不完全1640培養(yǎng)液混勻，用人淋巴細胞分離液經(jīng)密度梯度離心法獲取外周血單個核細胞。用磷酸鹽緩沖

4、液洗滌后，調整細胞濃度5×106/ml－1×107/ml。
　　流式細胞儀檢測法取上述細胞懸液，分別加入抗人 CD3-FITC，抗人CD3-APC，抗人Vδ1-PE，抗人γδ-TC，抗人Vδ1-FITC，抗人Vδ2-PE表面染色后，用流式細胞儀檢測。數(shù)據(jù)分析采用Cell Quest軟件，計算Vδ1+，Vδ2+細胞以及Vδ1－/Vδ2－(即Vδ3～8+)細胞各自在γδT細胞中的百分比。
　　熒光定量RT－PCR檢測法取上述細胞

5、懸液用Trizol裂解后提取RNA并用超微量核酸蛋白檢測儀鑒定RNA質量，合格者用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒按標準加樣后在PCR儀上逆轉錄得到cDNA，再將cDNA按標準加入SYBR Green Reagents熒光試劑，放入實時熒光定量PCR儀反應，反應參照基因為甘油醛-3-磷酸脫氫酶。所得數(shù)據(jù)將δ1-8基因循環(huán)數(shù)與內參的差值?經(jīng)過2-?換算后得到各基因相對表達量，并計算均

6、數(shù)和標準差。
　　結果：⑴36例健康成年人中，流式細胞儀檢測，大多數(shù)人γδT細胞δ2亞群所占比例最高；實時熒光定量 RT-PCR法檢測 Vδ1-8基因，δ2基因相對表達量為0.0955±0.006，占總γδT細胞表達量的57.96％。其他基因按相對表達量由多到少排列，依次為δ3、δ1、δ7、δ8、δ4、δ5、δ6。⑵10例結核病人當中，流式細胞儀檢測，大多數(shù)人γδT細胞主要以δ1亞群為主；實時熒光定量RT-PCR法檢測δ1-8基因

7、，δ1基因相對表達量為0.01723±0.0001，占總γδT細胞表達量的46.60%。δ2基因相對表達量為0.0042±0.0007，僅占總γδT細胞表達量的11.44%。其他基因按相對表達量由多到少排列，依次為δ5、δ6、δ4、δ7、δ3、δ8。⑶統(tǒng)計學驗證相關系數(shù)，健康成年人組的Vδ1組，Vδ2組，Vδ1－/Vδ2－(即Vδ3-8+)組R2在0.941到0.985間，結核病人組的Vδ1組，Vδ2組，Vδ3-8組R2在0.967到0

8、.990間，(P<0.05)。
　　結論：①流式細胞術和實時定量PCR技術檢測發(fā)現(xiàn)，36例健康成年人γδT細胞亞群中，以Vδ2亞群比例最高（占總γδT細胞57.96%），其他亞群的比例由多到少依次為δ3、δ1、δ7、δ8、δ4、δ5、δ6。②與健康成年人不同，10例結核病人的γδT細胞主要以δ1亞群為主（占總γδT細胞46.60%），其他亞群的比例由多到少依次為δ5、δ6、δ2、δ4、δ7、δ3、δ8。③流式細胞儀檢測法與實時定量