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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
探討miR-30c在調(diào)控細(xì)胞分化中的作用及對(duì)脊椎動(dòng)物早期胚胎發(fā)育的影響。
方法:
1、生物信息學(xué)分析:1)從miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.mirbase.org/)中獲取各物種miR-30家族成員的核苷酸序列,并用軟件Clustal W進(jìn)行多序列比對(duì)。2)以miR-30家族成員各自原始轉(zhuǎn)錄本(pri-miR-30)核苷酸序列為基礎(chǔ)的種系樹由軟件MEGA5中鄰接法(neighbor-jo
2、iningmethod)計(jì)算建立。
2、TaqMan PCR技術(shù)和胚胎整體原位雜交技術(shù):斑馬魚基因組DNA抽提,PCR和探針質(zhì)粒構(gòu)建,地高辛標(biāo)記反義RNA探針準(zhǔn)備,胚胎整體原位雜交,基于TaqMan PCR技術(shù)的miRNA表達(dá)分析。
3、顯微注射miR-30c-duplex、顯微注射嗎啡啉(morpholino)環(huán)標(biāo)記的反義寡核苷酸:分別將morpholino(嗎啡啉修飾反義寡核苷酸鏈morpholino,dre-m
3、iR-30c-MO)、duplex(miR-30c-duplex)和mRNA(體外轉(zhuǎn)錄合成的egfp-cxcr4a-3'UTR mRNA、egfp-cxcr4a-3'UTR(miR-30cmut)mRNA)經(jīng)顯微注射進(jìn)入胚胎細(xì)胞并設(shè)對(duì)照組。
4、進(jìn)行miRNA靶基因預(yù)測(cè)分析并和全胚胎miRNA靶基因報(bào)道系統(tǒng)比對(duì)。
結(jié)果:
1、miR-30c母源性低表達(dá),原腸后期至體節(jié)中期呈廣泛表達(dá)且中內(nèi)胚層表達(dá)豐富,受精后
4、24小時(shí)特異性表達(dá)于胚胎原腎管。
2、過表達(dá)miR-30c斑馬魚胚胎表現(xiàn)為中內(nèi)胚層細(xì)胞向胚胎中線遷移能力下降,最終呈現(xiàn)雙心畸形和內(nèi)臟畸形。
3、特異性抑制miR-30c的成熟,可增強(qiáng)斑馬魚胚胎中內(nèi)胚層細(xì)胞向中線遷移的能力。
4、細(xì)胞遷移相關(guān)因子cxcr4a是miR-30c的潛在靶基因之一。
結(jié)論:
1、初步探討miR-30c在胚胎發(fā)生早期的時(shí)空表達(dá)模式。
2、miR-30c是中
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