EZH2在侵襲性垂體腺瘤中蛋白質(zhì)和mRNA表達的臨床病理研究.pdf

1、目的：
　　EZH2是polycomb repressive complex2復(fù)合體中具有催化功能的亞基，主要功能為抑制催化組蛋白27位賴氨酸的三甲基轉(zhuǎn)移。在多種人類腫瘤中已經(jīng)證實了基因突變導(dǎo)致的EZH2高表達和調(diào)節(jié)功能失調(diào)，同時研究發(fā)現(xiàn)EZH2在人類腫瘤中與腫瘤細胞的惡性轉(zhuǎn)化、增殖、侵襲和腫瘤干細胞化密切相關(guān)。然而在人類垂體腺瘤組織中EZH2的表達情況目前仍未見報道。本實驗檢測了EZH2蛋白質(zhì)和mRNA在垂體腺瘤中的表達水平，同

2、時比較其在侵襲性垂體瘤和非侵襲性垂體腺瘤中的表達差異，并探討EZH2蛋白質(zhì)與MT1-MMP蛋白質(zhì)以及垂體腺瘤患者年齡、性別、腫瘤大小和激素類型等臨床病理因子間的相互關(guān)系。
　　方法：
　　本研究臨床及病理資料取自山東省立醫(yī)院神經(jīng)外科在2006年7月至2015年9月接受手術(shù)治療并術(shù)后病理學(xué)診斷為垂體腺瘤的62例患者（男性30例，女性32例），平均年齡為42.0±10.2歲?；颊卟v資料和影像學(xué)資料均保存齊全。該研究所有包含病例

3、獲得患者或家屬的知情同意，并簽訂知情使用同意書。
　　根據(jù)標準流程進行免疫組織化學(xué)檢測EZH2、Ki-67和MT1-MMP的表達。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果評價根據(jù)光鏡高倍視野(400×)下計數(shù)腫瘤細胞及呈現(xiàn)棕黃色或者棕褐色顆粒的陽性腫瘤細胞，得出陽性細胞占腫瘤細胞總數(shù)的百分率，無陽性細胞記為表達陰性(-);＜10％為弱陽性(+);10％～50％為中等陽性(++);≥50％為強陽性(+++)。一個標本的綜合得分取該標本5個視野的染色得分

4、均值。
　　根據(jù)說明書分別進行總RNA提取、cDNA文庫的制備和PCR反應(yīng)，檢測EZH2的mRNA表達量，并以β-actin作為內(nèi)參，計算EZH2基因mRNA的相對表達量。利用student t test分析侵襲性垂體腺瘤和非侵襲性垂體腺瘤中EZH2mRNA表達水平的差異。
　　根據(jù)標準流程（濕轉(zhuǎn)）進行western blot反應(yīng)，檢測EZH2蛋白質(zhì)的相對表達量，內(nèi)參蛋白采用β-actin。利用student t test分

5、析侵襲性垂體腺瘤和非侵襲性垂體腺瘤中EZH2蛋白質(zhì)表達水平的差異。
　　所有統(tǒng)計學(xué)圖片處理通過Photoshop CC和Graphpad Prism6.0進行。統(tǒng)計學(xué)處理利用SPSS20.0軟件進行。
　　結(jié)果：
　　1.免疫組織化學(xué)檢測EZH2蛋白和MT1-MMP在垂體腺瘤組織病理石蠟切片中的表達及其與臨床病理因素間的相關(guān)關(guān)系
　　免疫組織化學(xué)檢測顯示EZH2蛋白在垂體腺瘤組織中主要為細胞核染色，并伴有部分細胞

6、質(zhì)著色。EZH2蛋白在垂體腺瘤組織中表達的總陽性率高達88.7％(55/62)，其中侵襲性垂體腺瘤中陽性率為100％(30/30)，非侵襲性垂體腺瘤為78.1％(25/32)。根據(jù)體積分類，大腺瘤中EZH2陽性率為93.6％(44/47)，小腺瘤為73.3％（包括微腺瘤11/15）。Spearman rank correlation test結(jié)果顯示EZH2蛋白在侵襲性垂體瘤中的表達強度顯著高于非侵襲性垂體瘤(P=0.008)，同時在大

7、腺瘤中的表達強度顯著高于小腺瘤(P=0.018)。但是，EZH2蛋白與垂體腺瘤患者的性別(P=0.439)、年齡(P=0.694)和分泌激素類型(P=0.416)之間未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)意義。ANOVA分析結(jié)果顯示，Ki-67在EZH2不同表達強度間其大小差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。Dunnet T3兩兩分析顯示，Ki-67在EZH2陰性與所有陽性組別間均存在差異(P分別=0023，0.002和0.004)，在陽性組別間，弱陽性組小于

8、強陽性組(P=0.024)，但是弱陽性組和中度陽性組間(P=0.293)以及中度陽性組和強陽性組間(P=0.238)無明顯差異。
　　MT1-MMP蛋白在垂體腺瘤組織中主要為細胞質(zhì)和細胞膜著色。MT1-MMP蛋白在垂體腺瘤中的表達總陽性率為80.6％(50/62)。MT1-MMP蛋白質(zhì)在侵襲性垂體腺瘤(86.7％，26/30)中的表達率高于非侵襲性垂體腺瘤75％(24/32)。MT1-MMP的表達強度與EZH2表達強度密切相關(guān)(P

9、=0.002)。另外，MT1-MMP蛋白表達強度在侵襲性垂體腺瘤中大于非侵襲性垂體腺瘤(P=0.009)。但是，MT1-MMP與垂體腺瘤患者的性別(P=0.186)、年齡(P=0.652)、腫瘤體積(P=0.631)以及分泌激素類型(P=0.859)之間的相關(guān)性未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)意義。另外，Ki-67在不同MT1-MMP分組間無明顯表達差異(P＞0.05)。
　　2.PCR和western blot檢測新鮮冰凍組織中EZH2mRNA和蛋

10、白質(zhì)的表達差異
　　EZH2mRNA表達水平在侵襲性垂體腺瘤中高于非侵襲性垂體腺瘤(6.07倍，P＜0.001);EZH2蛋白質(zhì)表達水平在侵襲性垂體腺瘤中高于非侵襲性垂體腺瘤（3.61倍，P＜0.001）。
　　結(jié)論：
　　1.EZH2和MT1-MMP在垂體腺瘤中高頻率表達。
　　2.EZH2和MT1-MMP與人類垂體腺瘤的侵襲性生物學(xué)行為密切相關(guān)，在侵襲性垂體腺瘤中的表達強度高于非侵襲性垂體腺瘤。EZH2同時與