雷奈酸鍶對(duì)內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)誘導(dǎo)豚鼠繼發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎的作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)導(dǎo)致豚鼠繼發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎模型的觀察
　　目的:探討豚鼠內(nèi)側(cè)半月板切除（medial menisectomy,MNX）后關(guān)節(jié)炎的發(fā)生特點(diǎn)、軟骨組織病理變化，來(lái)評(píng)價(jià)骨性關(guān)節(jié)模型的建立是否成功，為后期實(shí)驗(yàn)提供正確的使用模型。
　　方法:
　　1、3月齡雄性DH豚鼠24只，隨機(jī)將動(dòng)物分為2組（n=12）：Sham組和MNX組，分別行假手術(shù)和內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)。
　　2、所有動(dòng)物術(shù)后飼養(yǎng)12周處死，利

2、用OARSI關(guān)節(jié)評(píng)分系統(tǒng)對(duì)關(guān)節(jié)退變情況進(jìn)行評(píng)估，利用免疫組化技術(shù)對(duì)軟骨組織中OA相關(guān)因子表達(dá)水平進(jìn)行分析，利用Micro-CT技術(shù)對(duì)脛骨平臺(tái)側(cè)的軟骨下骨進(jìn)行掃描記錄，分析內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)對(duì)軟骨下骨的作用。
　　結(jié)果:
　　1、兩組動(dòng)物體重隨時(shí)間逐漸增長(zhǎng)，各時(shí)間點(diǎn)兩組間體重?zé)o顯著差異；
　　2、 OARSI大體評(píng)分結(jié)果顯示， MNX組評(píng)分高于Sham組（MNX組vs.Sham組，2.92±0.20 vs.0.83±0.5

3、2，P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　3、 MNX組動(dòng)物術(shù)后關(guān)節(jié)退變嚴(yán)重，OARSI組織學(xué)評(píng)分顯示MNX組總分及CS、PG、CL和OST子項(xiàng)評(píng)分均顯著高于Sham組（P<0.05）；
　　4、與Sham組相比，MNX動(dòng)物的脛骨平臺(tái)軟骨負(fù)重區(qū)AGG表達(dá)水平顯著下降（P＜0.001），ADAMTS4（P＜0.05）、Caspase3（P＜0.001）和MMP13（P＜0.05）的表達(dá)水平則顯著增高。此外，AGG/ADAM

4、TS4比值（P＜0.05）和Col-II/MMP13比值（P＜0.05）顯著下降，而Col-II/AGG比值顯著升高（P＜0.05）。
　　5、 Micro-CT檢測(cè)結(jié)果：MNX組可見(jiàn)關(guān)節(jié)邊緣內(nèi)側(cè)緣性骨組織增生明顯，脛骨上端下骨小梁顯著減少。與Sham組相比，MNX組動(dòng)物脛骨平臺(tái)軟骨下骨BMD顯著降低（P＜0.05），BV/TV、Tb.Th顯著降低（P＜0.05）， Tb.Sp和SMI顯著增加（P＜0.05）。
　　第二部分

5、：雷奈酸鍶對(duì)內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)誘導(dǎo)豚鼠關(guān)節(jié)炎的作用
　　目的:Dunkin-Hartley（DH）豚鼠內(nèi)側(cè)半月板切除（MNX）導(dǎo)致繼發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）模型后，早期應(yīng)用雷奈酸鍶（strontium ranelate，SR），探討SR對(duì)MNX豚鼠關(guān)節(jié)炎的作用。
　　方法:
　　1、3月齡DH雄性豚鼠36只，隨機(jī)分為三組，每組各12只：MNX+NS組、MNX+CLX組和MNX+SR組，每組再隨機(jī)

6、分成2個(gè)亞組（n=6）,一亞組用于大體觀察，另一亞組用于組織學(xué)觀察，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后對(duì)各組進(jìn)行右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)。
　　2、術(shù)后一周開(kāi)始給藥， MNX+SR組給予SR625mg/kg/d灌胃， MNX+CLX組給予CLX20mg/kg/day灌胃，MNX+NS組給予等量生理鹽水灌胃。
　　3、給藥12周后，處死動(dòng)物并解剖右膝關(guān)節(jié)。通過(guò)肉眼觀察脛骨平臺(tái)和股骨髁的顏色、平滑度、滑液性狀和關(guān)節(jié)表面磨損情況。應(yīng)用OARSI進(jìn)行

7、關(guān)節(jié)大體評(píng)分。制備標(biāo)本切片，進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色，依據(jù)OARSI組織學(xué)評(píng)分系統(tǒng)對(duì)內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)損傷情況及骨贅情況進(jìn)行評(píng)分。
　　結(jié)果：
　　1、 DH豚鼠隨著年齡的增長(zhǎng)體重也逐漸增加。12周時(shí) MNX+NS組、CLX組和MNX+SR組體重?zé)o顯著差異，說(shuō)明SR給藥對(duì)豚鼠的生長(zhǎng)和發(fā)育沒(méi)有顯著影響，不影響體重。
　　2、軟骨的OARSI大體評(píng)分：造模術(shù)后內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)了明顯的磨損，脛骨內(nèi)側(cè)平臺(tái)軟骨表面變得粗糙，在軟骨的內(nèi)

8、側(cè)邊緣形成裂隙并有軟骨增生。給予CLX或SR的豚鼠術(shù)側(cè)OARSI大體評(píng)分均值較MNX+NS組略有降低，但均未見(jiàn)顯著差異。
　　3、軟骨組織學(xué)觀察結(jié)果：各組軟骨均發(fā)生嚴(yán)重退變，負(fù)重區(qū)軟骨嚴(yán)重受損，表現(xiàn)為軟骨缺失、甲苯胺藍(lán)染色減弱、形成細(xì)胞集群、潮線連續(xù)中斷、關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)邊緣有骨贅形成。OARSI組織學(xué)評(píng)分結(jié)果顯示：MNX+CLX組的總評(píng)分均顯著低于MNX+NS組（MNX+CLX組vs. MNX+NS組，10.78±1.91vs.17.3

9、6±1.92，P＜0.05），而MNX+SR組總評(píng)分與MNX+NS組相比未見(jiàn)顯著差異。軟骨厚度測(cè)量結(jié)果顯示，MNX+CLX組動(dòng)物軟骨厚度顯著高于MNX+NS組（MNX+CLX組 vs. MNX+NS組，360.19±38.93μmvs.264.73±58.01μm，P＜0.05），而MNX+SR組軟骨厚度與MNX+NS組相比未見(jiàn)顯著差異。此外，MNX+SR組骨贅高度顯著高于MNX+NS組（MNX+SR組vs. MNX+NS組，198.1

10、8±48.31μmvs.106.86±57.11，P＜0.05），MNX+CLX組骨贅高度略小于MNX+NS組，但未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4、骨贅?biāo)莸挠^察：大體觀察SR組中有5個(gè)樣品有塌陷骨贅的表現(xiàn)，而MNX組僅有1個(gè)樣本表現(xiàn)相同的外觀，CLX組未見(jiàn)類似現(xiàn)象，這種變化在三組之間無(wú)顯著差異。組織學(xué)觀察SR組有2個(gè)樣本發(fā)生塌陷，結(jié)合大體和組織學(xué)觀察，SR組發(fā)生骨贅?biāo)莸臉?biāo)本為7個(gè)，而MNX組僅有1個(gè)，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　

11、　第三部分：雷奈酸鍶對(duì)內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)誘導(dǎo)豚鼠關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制探討
　　目的:通過(guò)我們前部分的實(shí)驗(yàn)觀察，SR并未能起到對(duì)關(guān)節(jié)炎的滿意效果，發(fā)現(xiàn)其（625mg/kg/day）未能阻止MNX豚鼠軟骨的退變，甚至SR的攝入導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎骨贅的增生，甚至塌陷。因此，在本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)SR治療作用后的關(guān)節(jié)炎軟骨及軟骨下骨的進(jìn)一步研究，來(lái)探討產(chǎn)生這種現(xiàn)象的機(jī)制。
　　方法:
　　1、3月齡DH雄性豚鼠36只，隨機(jī)分為三組，每組各12只：M

12、NX+NS組、MNX+CLX組和MNX+SR組，每組再隨機(jī)分成2個(gè)亞組（n=6）,一亞組用于Micro-CT檢測(cè)，另一亞組用于免疫組化檢測(cè)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后對(duì)各組進(jìn)行右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)。
　　2、術(shù)后一周開(kāi)始MNX+SR組給予SR625mg/kg/day灌胃，MNX+CLX組給予CLX20mg/kg/day灌胃，MNX+NS組給予等量生理鹽水灌胃。
　　3、給藥12周后處死動(dòng)物，解剖右膝關(guān)節(jié), Micro-CT掃描檢測(cè)

13、脛骨平臺(tái)軟骨下骨，測(cè)定骨礦物質(zhì)密度（BMD）、骨微結(jié)構(gòu)指數(shù)（BV/TV），骨小梁厚度（Tb.Th），骨小梁數(shù)量（Tb.N），骨小梁分離度（Th.Sp）和結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)模型指數(shù) SMI），各向異性程度（DA）來(lái)分析給予CLX和SR對(duì)內(nèi)側(cè)半月板切除后軟骨下骨的影響。制備標(biāo)本切片后，進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，一抗分別為為：AGG（1：200），ADAMTS-4（1：200），Caspase-3（1：200），Col-II（1:50），和MMP-13（1：2

14、00）。
　　結(jié)果：
　　1、免疫組化結(jié)果：三組間AGG、Col-II、Caspase3和MMP13在內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)負(fù)重區(qū)的表達(dá)結(jié)果未見(jiàn)顯著差異，而MNX+CLX組的ADAMTS4在術(shù)側(cè)內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)負(fù)重區(qū)的表達(dá)水平顯著低于MNX+NS組（MNX+CLX組 vs. MNX+NS組，5243.96±2507.38 vs.11153.19±1958.72，P＜0.05）。此外，內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)負(fù)重區(qū)AGG/ADAMTS4表達(dá)水平的比值在

15、MNX+CLX組顯著高于MNX+NS組（MNX+CLX組 vs. MNX+NS組，1.28±0.63 vs.0.45±0.14，P＜0.05），而Col-II/MMP13和Col-II/AGG兩項(xiàng)指標(biāo)在三組間未見(jiàn)差異。
　　2、內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨下骨形態(tài)分析：CLX對(duì)軟骨下骨未造成顯著影響，而SR則顯著增強(qiáng)MNX豚鼠內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)負(fù)重區(qū)軟骨下骨BMD，并且顯著改善了BV/TV、Tb.Th、Tb.Sp和SMI等形態(tài)學(xué)參數(shù)。
　　結(jié)

16、論:
　　1、通過(guò)切除DH豚鼠右側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)半月板誘發(fā)關(guān)節(jié)退變，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨丟失、骨贅形成，軟骨基質(zhì)中以及軟骨細(xì)胞表達(dá)蛋白多糖顯著減少，軟骨組織中基質(zhì)成分與基質(zhì)降解酶類比例失調(diào)，軟骨細(xì)胞表達(dá)凋亡相關(guān)因子caspase-3增多，與典型的骨關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)類似。同時(shí)，DH豚鼠術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)負(fù)重區(qū)軟骨下骨有明顯的骨量丟失，這一表現(xiàn)符合早期骨關(guān)節(jié)炎軟骨下骨的表現(xiàn)。因此，DH豚鼠MNX模型是一種早期骨關(guān)節(jié)炎模型。
　　2、在S

17、R的作用下DH豚鼠MNX模型術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)負(fù)重區(qū)軟骨下骨的骨密度顯著提高，MNX導(dǎo)致的軟骨下骨形態(tài)改變被顯著抑制，但是未觀察到SR對(duì)MNX導(dǎo)致的關(guān)節(jié)退變有延緩作用，而目前臨床指南推薦用藥——塞來(lái)昔布表現(xiàn)出對(duì)關(guān)節(jié)退變有一定程度延緩作用。
　　3、雷奈酸鍶（625mg/kg/day）未能阻止MNX豚鼠軟骨的退變，這種結(jié)果產(chǎn)生的原因可能是由于SR未能抑制ADAMT4及MMP3的活性、進(jìn)而未能阻止細(xì)胞外基質(zhì)AGG降解，并且SR未能