microRNA-125a和microRNA-29a-b-c在胎盤植入中病理作用機制的研究.pdf

1、本文分為以下幾個章節(jié)進行探討：
　　第一章 胎盤植入中microRNA-125a，microRNA-29a/b/c和MCL1表達水平分析
　　目的：
　　1.檢測并分析miR-125a和miR-29a/b/c在胎盤植入部分與自身鄰近非植入組織中的表達是否存在差異。
　　2.檢測并分析植入和自身鄰近非植入組織中MCL1基因mRNA水平的表達及差異，并分析MCL1與miR-125a和miR-29a/b/c表達相關(guān)性。

2、
　　3.探討MCL1是否作為miR-125a和miR-29a/b/c的靶基因在胎盤植入中發(fā)揮作用。
　　方法：
　　1.采用自身對照的配對設(shè)計，收集新鮮未經(jīng)任何干預處理的母體面胎盤絨毛、類纖維蛋白層及基板層，植入部分還包括基板子宮肌層纖維。
　　2.提取組織中總RNA，應(yīng)用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈(RT-qPCR)反應(yīng)檢測胎盤植入部分及自身鄰近非植入部分組織中miR-125a，miR-29a/b/c和MCL1

3、的表達。
　　3.應(yīng)用載體(pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector,pmirGLO)構(gòu)建野生型MCL1-miR-125a-pmirGLO質(zhì)粒(WT-125)和野生型MCL1-miR-29a/b/c-pmirGLO質(zhì)粒(WT-29)。突變野生型質(zhì)粒中的種子區(qū)序列部分堿基成為突變型MCL1-miR-125a-pmirGLO質(zhì)粒(MUT-125)和突變型MCL1-mi

4、R-29a/b/c-pmirGLO質(zhì)粒(MUT-29)。用化學合成方法以miR-125a或miR-29a/b/c成熟核苷酸序列為模板分別合成microRNA模擬物，通過脂質(zhì)體Lipofectamine3000將miR-125a模擬物與WT-125或者MUT-125共轉(zhuǎn)染入293T細胞，將miR-29a/b/c與WT-29或者MUT-29共轉(zhuǎn)染入293T細胞。
　　4.雙熒光素酶報告基因檢測探討MCL1與miR-125a和miR-2

5、9a/b/c的靶基因關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.MiR-125a和miR-29a/b/c在胎盤植入部分組織中的表達水平明顯低于自身鄰近非植入部分組織，對應(yīng)的表達倍數(shù)分別是0.64;0.63;0.64;0.75(p=0.005;0.018;0.041;0.022)。
　　2.MCL1基因的mRNA在胎盤植入部分組織中表達水平明顯高于自身鄰近非植入部分組織，表達倍數(shù)為1.32(p=0.039)。
　　3.Pearso

6、n相關(guān)分析表明，胎盤植入組織中miR-125a和miR-29a/b/c的相對表達量與MCL1的相對表達量呈顯著負相關(guān)性(Pearson correlation=-0.701,-0.543,-0.876,-0.767, p＜0.05)。
　　4.雙熒光素酶報告基因檢測(luciferase activity assays)證實MCL1是miR-125a和miR-29a/b/c的靶基因(p=0.043，0.006，0.009，0.01

7、0)。
　　結(jié)論：
　　MiR-125a和miR-29a/b/c在胎盤植入組織較自身鄰近非植入組織表達水平顯著降低，相反MCL1 mRNA在胎盤植入部分組織中表達顯著增高，兩者在胎盤植入中的相對表達量呈明顯的負相關(guān)性。雙熒光素酶報告基因檢測證實MCL1是miR-125a和miR-29a/b/c的靶基因，推測miR-125a，miR-29a/b/c通過調(diào)控靶基因MCL1表達參與胎盤植入發(fā)生。
　　第二章 胎盤植入中mic

8、roRNA-125a和microRNA-29a/b/c調(diào)控滋養(yǎng)細胞生物學行為的研究
　　目的：
　　1.體外轉(zhuǎn)染滋養(yǎng)細胞系HTR-8/SVneo細胞，進一步驗證miR-125a和miR-29a/b/c對靶基因MCL1的負性調(diào)節(jié)作用。
　　2.探討miR-125a和miR-29a/b/c異常表達對滋養(yǎng)細胞凋亡生物學行為的影響。
　　3.確定抗凋亡滋養(yǎng)細胞的類型，初步探討miR-125a和miR-29a/b/c在胎盤

9、植入中的病理作用機制。
　　方法：
　　1.以miR-125a和miR-29a/b/c成熟核苷酸序列為模板，用化學合成方法分別合成microRNA的模擬物(miR-125a mimic，miR-29a/b/c mimics)，反義的microRNA抑制物(miR-125a inhibitor, miR-29a/b/c inhibitors)以及各自對應(yīng)的陰性對照序列(negative control,NC，inhibitor

10、 negative control，INC)。通過脂質(zhì)體Lipofectamine3000分別將模擬物、抑制物及各自對應(yīng)的陰性對照序列轉(zhuǎn)染滋養(yǎng)細胞系HTR-8/SVneo。
　　2.應(yīng)用RT-qPCR反應(yīng)檢測microRNAs轉(zhuǎn)染后HTR-8/SVneo細胞中MCL1 mRNA水平表達量的變化。應(yīng)用Western Blot方法檢測轉(zhuǎn)染后HTR-8/SVneo細胞中Mcl1蛋白水平表達量的變化。
　　3.應(yīng)用AnnexinⅤ/

11、PI對轉(zhuǎn)染后的HTR-8/SVneo細胞進行雙染，應(yīng)用流式細胞儀檢測HTR-8/SVneo細胞凋亡率。
　　4.對切除的子宮和胎盤組織進行組織病理切片，免疫組化染色病理組織切片定位Mcl1表達細胞類型，結(jié)合H&E染色觀察細胞形態(tài)、數(shù)量。
　　結(jié)果：
　　1.轉(zhuǎn)染HTR-8/SVneo細胞后，miR-125a和miR-29a/b/c模擬物轉(zhuǎn)染組中MCL1 mRNA表達水平較陰性對照組明顯下降，表達倍數(shù)為0.60，0.42

12、，0.58，0.43(p=0.0497，0.002，0.008，0.013);模擬物轉(zhuǎn)染組中MCL1的蛋白表達水平也明顯降低。
　　2.MiR-125a和miR-29a/b/c模擬物轉(zhuǎn)染后，HTR-8/SVneo細胞凋亡率較陰性對照組呈現(xiàn)增長趨勢。
　　3.H&E染色和免疫組化染色病理切片均觀察到種植部位中間型滋養(yǎng)細胞(ISIT)數(shù)量在植入部分基板子宮肌層纖維間隙明顯增多，免疫組化染色顯示MCL1主要在ISIT中表達。顯微鏡

13、下發(fā)現(xiàn)，相比于非植入部分，植入部分中間型滋養(yǎng)細胞細胞遷移至深部肌層內(nèi)血管壁內(nèi)現(xiàn)象更常見。
　　結(jié)論：
　　MiR-125a或miR-29a/b/c的過表達可顯著降低MCL1基因mRNA和蛋白的表達并促進HTR-8/SVneo細胞的凋亡。植入部分基板子宮肌層纖維間隙中主要表達MCL1的ISIT數(shù)量明顯增多。以上結(jié)果提示植入胎盤組織中miR-125a和miR-29a/b/c對靶基因MCL1異常調(diào)控導致植入部分基板子宮肌層纖維間隙