microRNA30b在神經(jīng)病理性疼痛中對SCN9A的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、背景與目的:
　　中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)損傷或功能障礙會引起以自發(fā)痛、痛覺過敏和痛覺超敏為特征的神經(jīng)病理性疼痛，其發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，不易治療。研究發(fā)現(xiàn)，SCN9A的單核苷酸突變與先天性痛覺異常疾病密切相關(guān)。SCN9A基因錯義突變會導(dǎo)致原發(fā)性紅斑肢痛癥(Primary erythermalgia，PE)和陣發(fā)性劇痛癥(paroxysmal extremepain disorder PEPD)，而SCN9A基因單堿基缺失則導(dǎo)致先天性無痛癥(c

2、ongenitalinability to experience pain CIP)。由此推測，SCN9A可能是疼痛發(fā)生和發(fā)展過程中的一個關(guān)鍵因素。SCN9A基因位于2號染色體，全長6000bp，有26個外顯子，編碼河豚毒素(TTX)敏感的電壓門控鈉離子通道Nav1.7的α亞基，主要表達(dá)在外周背根神經(jīng)節(jié)和交感神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中。
　　MicroRNA(miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，主要參

3、與轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)調(diào)控。當(dāng)miRNA與靶mRNA完全結(jié)合時，靶mRNA直接被降解;不完全結(jié)合時，則阻遏其翻譯蛋白。我們利用生物信息學(xué)軟件Targetscan進(jìn)行預(yù)測，miR-30b與SCN9A相關(guān)性最強(qiáng)，由此我們提出假說:正常生理狀態(tài)下，miR-30b能夠抑制SCN9A由mRNA向蛋白Nav1.7的翻譯，使Nav1.7保持穩(wěn)態(tài)。當(dāng)外周神經(jīng)損傷，miR-30b表達(dá)下調(diào)，減少了對SCN9A mRNA的抑制，使Nav1.7表達(dá)增加，從而導(dǎo)致神

4、經(jīng)元興奮性增強(qiáng)，最終引起病理性疼痛。
　　因此，本實(shí)驗(yàn)利用坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷（the sciatic nerve injury, SNI）制作大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型，通過過表達(dá)和抑制miR-30b的表達(dá)，檢測SCN9A mRNA水平和蛋白水平的變化，同時檢測大鼠痛閾變化驗(yàn)證所提假說，為神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)，為其治療提供新靶點(diǎn)。
　　方法:
　　(1)坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷模型(SNI)分別雙重結(jié)扎大

5、鼠脛神經(jīng)、腓總神經(jīng)，在雙重結(jié)扎的中央切斷，并分別去除斷端2～4mm的神經(jīng)干。
　　(2)50％縮足閾值的測定(von Frey test)大鼠在刺激時間內(nèi)出現(xiàn)快速的縮足反應(yīng)，記為陽性反應(yīng)，應(yīng)用Dixon(1980)報道的方法推算出50％縮足閾值。當(dāng)50％縮足閾值小于4 g時認(rèn)為出現(xiàn)痛敏。
　　(3) qRT-PCR熒光實(shí)時定量PCR為目前檢測miRNA最常用和最主要的方法，其具有快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。
　　(

6、4)免疫組化熒光雙標(biāo)用于對Nav1.7進(jìn)行定位和半定量的檢測，能直觀有效的展示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　(5) Western blot用于檢測Nav1.7蛋白表達(dá)量的變化。
　　(6)雙熒光素酶報告基因分析法熒光素和熒光素酶這一生物發(fā)光體系，可以極其靈敏、高效地檢測基因的表達(dá)。是檢測轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動子區(qū)DNA相互作用的一種檢測方法。
　　(7)鞘內(nèi)置管用5號注射器針頭刺入椎管鉆孔，然后用鑷子夾住導(dǎo)管尖端輕柔地將導(dǎo)管向上置

7、入，此時導(dǎo)管內(nèi)可見清亮的腦脊液流出。出現(xiàn)甩尾或抖動反射表明穿刺成功。導(dǎo)管置入深度約為1.5-2.0cm。
　　結(jié)果:
　　1.神經(jīng)病理性疼痛中，miR-30b表達(dá)減少，反之，SCN9A的表達(dá)增加。
　　2.miR-30b抑制SCN9A翻譯為Nav1.7。
　　3.鞘內(nèi)注射miR-30b類似物能緩解大鼠神經(jīng)病理性疼痛。
　　結(jié)論:
　　體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-30b參與調(diào)節(jié)SCN9A的表達(dá);在神經(jīng)病