支鏈淀粉酶CDS1-3的功能鑒定以及結(jié)構(gòu)分析和分子改造的研究.pdf

1、科研領(lǐng)域一直致力于研究從各種途徑來對支鏈淀粉進(jìn)行降解，如支鏈淀粉酶的對大分子底物的作用機(jī)制、高酶活的支鏈淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選、淀粉的水解工藝等方向。支鏈淀粉酶是一類能夠催化淀粉等多糖化合物中的α-1，6-糖苷鍵水解的一類酶的統(tǒng)稱。本研究旨在從對大分子底物的作用方式入手，研究支鏈淀粉酶對支鏈淀粉的作用機(jī)制，為支鏈淀粉酶的開發(fā)提供新的研究路徑。
　　本文從實(shí)驗(yàn)室保存的基因文庫中克隆出長度為1764 bp的支鏈淀粉酶基因cds1-3，并成

2、功構(gòu)建了重組菌DH5α/pSE380-cds1-3。通過鎳柱親和層析純化、離子交換手段純化得到純的支鏈淀粉酶CDS1-3。該酶最適溫度為50℃，最適pH為5.5。CDS1-3對不同底物的催化降解的效率差異較大，降解能力大小排序依次為:α-環(huán)糊精＞可溶性淀粉＞普魯蘭糖＞木薯淀粉＞支鏈淀粉。重組酶CDS1-3對O-環(huán)糊精的Vmax和Km分別為19.45μ mol/(min*mg)、1.63 mg/L;而對可溶性淀粉的Vmax和Km分別為20

3、.23μ mol/(min*mg)、39.52 mg/L;以支鏈淀粉為底物時，Vmax和Km分別為37.95μ mol/(min*mg)、184.9 mg/L。重組酶CDS1-3與地衣芽孢桿菌α-淀粉酶協(xié)同作用降解小分子底物時存在負(fù)協(xié)同效應(yīng)，降解大分子底物支鏈淀粉時則表現(xiàn)為正協(xié)同效應(yīng)。通過對比發(fā)現(xiàn)，模式菌Thermus sp.IM6501所產(chǎn)支鏈淀粉酶與本研究中的支鏈淀粉酶CDS1-3氨基酸序列上高度相似，相似性為94.7％。但對大分子

4、底物降解能力存在較大差異。CDS1-3是一個非常好的研究支鏈淀粉水解的出發(fā)蛋白質(zhì)，以此為出發(fā)點(diǎn)，通過對支鏈淀粉酶CDS1-3進(jìn)行同源建模、結(jié)構(gòu)分析，最后選定位點(diǎn)Glu66、Pro48、Phe289進(jìn)行突變。
　　采用核苷酸引物介導(dǎo)的定點(diǎn)突變對原始的支鏈淀粉酶CDS1-3進(jìn)行分子改造。獲得了三個突變體:E66G、P48H、F289A。其中只有E66G具有酶活。利用鎳柱純化和離子交換層析的方法得到純的突變酶E66G。通過底物特異性分析