肌強直綜合佂臨床分型的分子生物學(xué)分析.pdf

1、肌強直綜合征(Myotonic myopathies，MM)是一組原發(fā)/繼發(fā)離子通道蛋白（CL-/Na+/Ca2+/K+）結(jié)構(gòu)/功能異常、骨骼肌細(xì)胞膜去極化紊亂、持續(xù)重復(fù)放電的遺傳性骨骼肌疾病，臨床表現(xiàn)為:肌肉僵直/肌強直、肌肉萎縮朋巴大、肌無力;電生理呈典型肌強直電位，伴/不伴肌病電位。根據(jù)臨床癥狀分為萎縮性肌強直(Dystrophic myotonia，DM)及非萎縮性肌強直(Non-dystrophic myotonias, ND

2、Ms)。
　　本研究基于骨骼肌遺傳資源標(biāo)本庫(2004.9-2014.12)，從1356例骨骼肌疾病篩選強直性肌營養(yǎng)不良（25例，含6例家系）、非萎縮性肌強直（17例，含5例家系），進(jìn)行肌強直綜合征的臨床及分子生物學(xué)研究，旨在建立DMs及NDMs分子生物學(xué)診斷平臺，報告中國人群肌強直綜合征基因變異特點，回顧性分析臨床及骨骼肌病理特點，豐富肌強直綜合征的臨床表型及遺傳表型，嘗試鈉通道阻滯劑（卡馬西平/美西律）治療肌強直綜合征，減輕臨

3、床癥狀，為產(chǎn)前診斷提供分子生物學(xué)依據(jù)。
　　第一部分 優(yōu)化PCR應(yīng)用于強直性肌營養(yǎng)不良分子生物學(xué)診斷
　　目的:DMs由DMPK(DM1)/Znf9(DM2)非編碼區(qū)(CTG)n/(CCTG)n核苷酸重復(fù)序列異常擴(kuò)增致病。
　　DMs高度臨床/遺傳異質(zhì)性以及基因變異特點，使PCR方法檢測核苷酸重復(fù)序列數(shù)成為其最終診斷的可靠方法。大片段核苷酸序列的擴(kuò)增及模板高GC含量對擴(kuò)增效率的影響顯著限制PCR診斷效率，建立符合DM基

4、因變異特點的分子生物診斷方法是臨床的迫切需求，優(yōu)化傳統(tǒng)PCR引物序列，變性、退火及延長等反應(yīng)程序檢測核苷酸重復(fù)序列數(shù)目，是本研究的技術(shù)關(guān)鍵。
　　方法:
　　1.在遺傳性骨骼肌疾病資料標(biāo)本庫中標(biāo)本篩選42例肌強直綜合征患者（11例家系）作為優(yōu)化PCR檢測對象。
　　2.基因分析
　?、俸炇鹬橥鈺槿?ml外周靜脈血提取基因組DNA。以Primer5.0軟件進(jìn)行PCR反應(yīng)引物序列設(shè)計，覆蓋DMPK，ZNF9基

5、因全長。
　?、趥鹘y(tǒng)PCR反應(yīng)參數(shù)優(yōu)化，包括變性、退火、延伸階段時間、溫度。
　　③對上述入選病例及家系成員進(jìn)行DMPK及Znf9擴(kuò)增，2.5％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行產(chǎn)物分離純化，DHPLC進(jìn)行DMs雜合/純合樣品檢測驗證
　?、蹵BI377自動測序儀進(jìn)行測序分析，將測序結(jié)果以Sequencher4.90軟件正常人類基因組參照序列進(jìn)行比對分析。
　　結(jié)果:
　　1.最終引物序列:
　　DMPK(450bp

6、):
　　Forward primer:5'-CGA CTC CGG GGC CCC GTT GGA AGA CT-3';
　　Reverse primer:5'-CTC CCC AGA GCA GGG CGT CAT GCA CAAG-3';
　　ZNF9(295bp):
　　Forward primer:5'-GGC CTT ATA ACC ATG CAA AT-3';
　　Reverse primer

7、:5'-GCC TAG GGG ACA AA GTGAGA-3';
　　2.優(yōu)化傳統(tǒng)PCR反應(yīng)程序:
　?、賰?yōu)化DMPK循環(huán)參數(shù)。
　?、趦?yōu)化Znf9循環(huán)參數(shù)。
　?、垩h(huán)體系最終確立，反應(yīng)體系中不添加任何輔助添加劑。
　　④DHPLC純合/雜合檢測。
　　3.基因診斷分型:
　　應(yīng)用優(yōu)化PCR對42例入選樣本進(jìn)行基因診斷分型，22例DMPK純和樣本;20例DMPK雜合樣本。2.5％瓊脂糖凝膠電

8、泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物。正常對照PCR擴(kuò)增產(chǎn)物450bp，(CTG)n重復(fù)數(shù)約為20。22例患者(CTG)n重復(fù)數(shù)53-683，平均CTG）n重復(fù)序列數(shù)約535。對17例先證者家系成員進(jìn)行(CTG)n重復(fù)數(shù)檢測，證實5例女性患者的兒子(CTG)n異常擴(kuò)增，平均(CTG)n重復(fù)數(shù)約520次。1例男性患者母親及小姨(CTG)n重復(fù)序列數(shù)分別為103、180次。優(yōu)化傳統(tǒng)PCR對3例雜合樣本及4例無關(guān)對照個體進(jìn)行Znf9擴(kuò)增，2.5％瓊脂糖凝膠電泳分離

9、擴(kuò)增產(chǎn)物。正常對照PCR擴(kuò)增產(chǎn)物295bp，(CCTG)n重復(fù)數(shù)約為20次。結(jié)果示3例患者(CCTG)n重復(fù)序列數(shù)400-450次，平均(CCTG)n重復(fù)序列數(shù)約416次。17例樣本DMPK及Znf9陰性。
　　結(jié)論:
　　1.高GC含量樣本在PCR反應(yīng)引物序列設(shè)計時，設(shè)定較高退火溫度(Tm)可有效降低ΔG反應(yīng)能，提高PCR擴(kuò)增反應(yīng)效率。
　　2.高GC含量樣本的PCR反應(yīng)程序設(shè)定，縮短退火時間、提高退火溫度、增加延伸

10、反應(yīng)時間及升高延伸溫度能有效提高擴(kuò)增效率。
　　3.本研究優(yōu)化PCR反應(yīng)，建立了高效、經(jīng)濟(jì)及簡便DM分子生物學(xué)診斷方法，可應(yīng)用DM的分子生物學(xué)診斷及鑒別診斷，推薦廣泛臨床應(yīng)用。
　　第二部分 強直性肌營養(yǎng)不良臨床及骨骼肌病理研究
　　目的:本研究回顧性分析25例臨床、病理及優(yōu)化PCR基因檢測診斷為DMs患者臨床資料，總結(jié)、分析中國DMs臨床表型及骨骼肌病理特點。
　　方法:
　　1.臨床病例資料收集

11、　　回顧性總結(jié)分析25例第一部分研究明確診斷證實為DMs患者臨床病例資料。
　　2.骨骼肌病理分析
　　全部患者簽署病理診斷及分子生物學(xué)診斷知情同意書。肱二頭肌開放式骨骼肌活檢獲取標(biāo)本(1×0.5 cm)，迅速異戊烷/液氮冷凍，13種常規(guī)組織化學(xué)、酶學(xué)染色（蘇木精-伊紅、改良Gomori三原色、還原型輔酶Ⅰ-四氮唑還原酶、琥珀酸脫氫酶、單磷酸腺苷脫氨酶、細(xì)胞色素C氧化酶、三磷酸腺苷環(huán)化酶、酸性磷酸酶、過碘酸雪夫氏、油紅O/蘇

12、丹黑B）。
　　結(jié)果:
　　1.22例確診DMs基本臨床表現(xiàn):電生理肌強直電位/伴少量肌病電位，美西律、卡馬西平聯(lián)合治療肌強直癥狀顯著改善。22例DM1，9例男性，13例女性，四肢遠(yuǎn)端肌起病肌無力、肌萎縮（動作笨拙緩慢僵硬），叩擊性肌球(+)，17/22 DM1不同程度伴心臟?。ㄊ鲗?dǎo)阻滯為主）、白內(nèi)障(7)、甲狀腺(1)、內(nèi)分泌(1)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累(6);3例DM2四肢近端肌無力起病，肌球(+)，臨床癥狀輕，3例伴不

13、同程度心臟功能異常，余系統(tǒng)受累（-）。
　　2.骨骼肌病理:肌源性改變，散在肌纖維變性、壞死、再生，結(jié)締組織輕至中度增生;可見中心核、核內(nèi)移、肌漿塊、核聚集;部分肌纖維酶活性局灶降低，可見蟲噬樣肌纖維、環(huán)狀肌纖維。DM1小角化散在;DM1Ⅱ型肌纖維優(yōu)勢、群化，DM2Ⅰ型肌纖維優(yōu)勢。
　　結(jié)論:
　　1.中國人群DMs中DM1發(fā)病率顯著高于DM2，臨床表現(xiàn)典型肌強直伴肌無力、肌肉萎縮，伴多系統(tǒng)受累“綜合臨床表型”，與既往

14、DMs臨床表型報道無顯著差異。
　　2.DMs骨骼肌病理分析出現(xiàn)上述典型病理表現(xiàn)可提示診斷DMs，DM1Ⅱ型肌纖維優(yōu)勢、群化，DM2Ⅰ型肌纖維優(yōu)勢。
　　3.DM1臨床及骨骼肌受累程度與(CTG)n呈正相關(guān)，核苷酸重復(fù)序列數(shù)目越多，臨床表型越重，起病越早;DM2與發(fā)病年齡及病程呈正相關(guān)。
　　第三部分 非萎縮性肌強直臨床及分子生物學(xué)研究
　　目的:本研究對入選17例NDMs（包括5例先證者家系成員）進(jìn)行臨床、骨骼

15、肌病理分析研究，并應(yīng)用分子生物學(xué)方法明確診斷分型，初步探討該組疾病在中國人群發(fā)病及基因變異特點。
　　方法:
　　1.病例篩選
　　選取第一部分研究中17例DMs篩查陰性患者列入組研究。
　　2.活檢骨骼肌病理分析，同第一部分。
　　3.基因檢測
　　應(yīng)用Primer5軟件進(jìn)行PCR反應(yīng)引物設(shè)計，覆蓋CLCN-1、SCN4A、KCNE3、CACNA1S基因全長，包括23個外顯子、24個外顯子、3個外顯

16、子、44個外顯子及內(nèi)含子交界區(qū)。進(jìn)行相關(guān)致病基因變異位點檢測。
　　結(jié)果:
　　1.研究基因分析CLCN-1檢測陽性率47％(8/17)，新發(fā)7個致病基因位點集中分布在8、12號外顯子區(qū)域;SCN4A檢測陽性率29％(4/17)，新發(fā)3個致病位點集中分布在22、24號外顯子區(qū)域。根據(jù)基因分型臨床診斷:8例先證者明確診斷MC（1例DMC）;4例先證者明確診斷PC;MC發(fā)病人群顯著高于PC。
　　2.NDMs多5-10歲起

17、病，臨床以肌強直為主癥，電生理呈肌強直電位，極少伴肌病電位，患者有繼發(fā)跟腱攣縮、脊柱側(cè)彎現(xiàn)象，部分伴心功能異常。給予卡馬西平及美西律聯(lián)合治療肌強直癥狀可得到顯著緩解。
　　317例NDMs活檢骨骼肌肌源性改變，未發(fā)現(xiàn)特異性病理結(jié)構(gòu)改變，部分重癥患者可見肌細(xì)胞變性、壞死、再生，酶活性局灶降低，散在小角化肌纖維（Ⅰ型為主）。9例MC出現(xiàn)ⅡB肌纖維缺如，該特點可用于MC及PMC鑒別診斷。與DMs相區(qū)別:NDMs無特異性結(jié)構(gòu)改變及活躍肌纖

18、維變性、壞死、結(jié)締組織重度增生等強直性肌營養(yǎng)不良病理改變，提示活檢骨骼肌病理分析有助于強直性肌營養(yǎng)不良與非萎縮性肌強直鑒別診斷，但并能作為該組疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)論:
　　1.基因檢測分析是NDMs診斷及分型診斷的金標(biāo)準(zhǔn);NDMs涉及致病基因多，二代測序技術(shù)的推廣能更好用于該組疾病的診斷與分型診斷。
　　2.中國人群存在新發(fā)CLCN-1/SCN4A致病突變位點，上述致病位點目前尚無數(shù)據(jù)庫報道，擴(kuò)大了上述基因致病譜