制備液相色譜中整體蛋白高效快速分離新策略.pdf

1、隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究熱潮的到來(lái)，對(duì)于整體活性蛋白的分離和制備已成為影響蛋白質(zhì)組學(xué)研究向縱深發(fā)展的一大難題。一方面，為獲得更多蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能信息，必需足夠量的高純度的活性蛋白；另一方面，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)研究成果開(kāi)發(fā)與生產(chǎn)活性蛋白質(zhì)藥物急需高效的分離技術(shù)并降低生產(chǎn)成本。因此，研究制備規(guī)模下整體蛋白快速、高分辨分離的新策略是解決上述問(wèn)題的關(guān)鍵。 本文首次提出了制備色譜中蛋白分離的五“S”策略，即使用短柱(Shortcolumn)裝填小

2、顆粒填料(Smallparticles)，在單位柱橫截面上(cross—Sectionalareaperunit)樣品較小的質(zhì)量過(guò)載(Smallsampleoverload)和適宜的低線流速(Suitablelowlinearvelocity)條件下進(jìn)行活性蛋白高效快速的分離。 緒論。介紹了整體蛋白分離與制備的意義、分離技術(shù)和液相色譜分離介質(zhì)的研究進(jìn)展；對(duì)色譜餅及其用于蛋白分離的理論、技術(shù)和應(yīng)用的研究作了回顧；簡(jiǎn)述了制備色譜的發(fā)

3、展及其與分析色譜的異同，引用文獻(xiàn)150篇。 實(shí)驗(yàn)部分。包括了本文中所用的儀器、材料、實(shí)驗(yàn)方法。 整體蛋白液相色譜分離的五“S”策略。全面比較了色譜柱和色譜餅分離整體蛋白時(shí)的分離度與峰容量；在分析規(guī)模下短色譜柱(色譜餅)和常規(guī)長(zhǎng)色譜柱上這兩者相當(dāng)，在制備規(guī)模下，同樣柱體積的色譜餅分離效果優(yōu)于色譜柱；裝填較細(xì)硅膠基質(zhì)填料的色譜餅在分離制備蛋白時(shí)能取代“軟”基質(zhì)的商品填料。基于此首次提出了制備色譜中蛋白快速、高分辨分離的五“S

4、”策略。 五“S”策略與熱力學(xué)因素。對(duì)生物大分子的色譜保留行為進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其在液相色譜分離過(guò)程中存在洗脫濃度窗口，用計(jì)量置換保留理論對(duì)此進(jìn)行了解釋。通過(guò)對(duì)溶質(zhì)與固定相、流動(dòng)相之間分子相互作用機(jī)理的探討，闡明了溶質(zhì)在色譜柱床上復(fù)雜的吸附、解吸附過(guò)程及其內(nèi)在特點(diǎn)。提出條件分離度、有效柱長(zhǎng)比和單位橫截面積的樣品負(fù)載密度三個(gè)新概念，用來(lái)解釋超載狀態(tài)下蛋白在色譜柱床上具有優(yōu)異分離性能的原因。闡明了在此條件下提高蛋白分離度的有效途徑為增

5、加柱內(nèi)徑，降低柱床上樣品吸附層的厚度和樣品負(fù)載密度，同時(shí)為增大高流速下蛋白的產(chǎn)量應(yīng)適當(dāng)減小柱長(zhǎng)；表明色譜餅是實(shí)現(xiàn)五“S”策略的首選柱技術(shù)。 五“S”策略與動(dòng)力學(xué)的影響。分別考察了不同粒徑的色譜填料、填充方式和色譜柱特征對(duì)蛋白分離和譜帶擴(kuò)展的影響。隨著填料粒徑的減小，蛋白的分離效果逐漸變好，色譜餅的幾何結(jié)構(gòu)使得其填料裝填密度要高于同體積的常規(guī)色譜柱，并因此減弱了蛋白的譜帶展寬。研究不同流速下蛋白的分離，以條件塔板高度對(duì)流速作圖，表

6、明色譜餅具有比色譜柱較小的最佳線流速和較寬的最佳流速范圍。提出以條件分離度與流速關(guān)系曲線確定和表征色譜分離的優(yōu)化條件。在色譜餅上對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白進(jìn)行了高效快速分離的優(yōu)化，與文獻(xiàn)對(duì)比，色譜餅的樣品負(fù)載量大，分離效果好，質(zhì)量回收率和回收樣品濃度高。 五“S”策略的應(yīng)用。用疏水色譜餅在6min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了人血清樣品的一步快速分離制備。采用基于色譜餅的二維液相色譜成功實(shí)現(xiàn)了不同色譜模式之間緩沖溶液交換和人血清樣品在70min內(nèi)快速在線二維分離，在