殼聚糖對去乙酰真菌環(huán)氧乙酯合成的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、海洋微生物生境特殊，具有獨特的代謝途徑。海洋微生物的次級代謝產(chǎn)物是新藥物研究開發(fā)的重要資源。如何提高微生物的次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，是目前海洋微生物開發(fā)亟待解決的問題。近年來，使用誘導子來刺激代謝途徑已經(jīng)成為提高目的產(chǎn)物產(chǎn)量的主要策略之一。
　　 本論文嘗試采用誘導子來提高海洋抗腫瘤候選新藥去乙酰真菌環(huán)氧乙酯(Deacetylmycoepoxydiene，縮寫為DAM)的產(chǎn)量，并對誘導機制進行初步的探索。DAM是紅樹植物內(nèi)生真菌A1

2、23(Phomopsis sp.A123)產(chǎn)生的一種骨架新穎的環(huán)氧二烯類化合物。前期研究表明，DAM具有較強的細胞毒性，對Raji細胞株IC50為3.0g/mL，對胃癌AGS細胞株IC50為1.0μg/mL，具有較好的藥用開發(fā)前景。但是野生菌株發(fā)酵產(chǎn)量極低，PDA固體發(fā)酵產(chǎn)量僅為0.8mg/L，限制了對DAM的進一步研究。
　　 在前期搖床培養(yǎng)基質(zhì)優(yōu)化的基礎上，本文選擇和制備了16種誘導子，研究了它們在液體培養(yǎng)條件下對DAM高產(chǎn)

3、突變株139的DAM產(chǎn)量的影響，結(jié)果表明，白色假絲酵母菌體制備物和殼聚糖具有顯著的正調(diào)節(jié)作用。采用CCD設計響應面實驗，得到了殼聚糖誘導子的最佳誘導條件：殼聚糖接種時間為發(fā)酵后的144h、濃度100mg/L。DAM最高產(chǎn)量可比空白對照提高36％。進一步對誘導條件進行優(yōu)化，DAM的終產(chǎn)量可以提高1.5倍，為工業(yè)生產(chǎn)上提高DAM產(chǎn)量、縮短生產(chǎn)周期奠定了基礎。
　　 為了研究殼聚糖對菌株139誘導過程中發(fā)生的生理生化變化，本文對實驗組

4、和對照組發(fā)酵液分別進行了生物量、DAM產(chǎn)量、殘?zhí)堑臏y定以及菌體形態(tài)觀察的實驗。結(jié)果顯示殼聚糖的加入促進了菌株的一些生理變化，尤其是菌體提前產(chǎn)生了自溶現(xiàn)象。
　　 采用Real-timePCR等技術，初步探討了殼聚糖提高DAM產(chǎn)量的可能機制。通過簡并引物設計，從菌株139中克隆出信號轉(zhuǎn)導蛋白的保守片段，得到G蛋白的α亞基、MAPK蛋白和PKA蛋白的保守序列；通過Real-time PCR檢測得出G蛋白的表達量在誘導2h內(nèi)基本沒有變

5、化，5h下調(diào)了5.89倍。而MAPK蛋白在誘導1h、2h、5h時分別下調(diào)了1.49、2.28、10.57倍；推測誘導作用可能是通過信號轉(zhuǎn)導途徑將外界信號傳遞到細胞核，導致相關基因轉(zhuǎn)錄水平變化。其次，在前人研究基礎上，探究殼聚糖的加入對DAM合成相關酶的表達變化影響，發(fā)現(xiàn)酯酶、細胞色素P450單氧合酶和NAD依賴性的脫水酶這3種后修飾酶在發(fā)酵第168h和第216h時伴隨著DAM產(chǎn)量的提高均有不同程度的上調(diào)。因此推測殼聚糖提高DAM產(chǎn)量的機