順鉑和來曲唑?qū)Υ笫笞訉m內(nèi)膜異位癥的作用研究及臨床問題研究.pdf

1、子宮內(nèi)膜異位癥形成“三步曲”：粘附、侵襲、血管形成，同時(shí)內(nèi)異癥的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，與腫瘤極其相似，因此，內(nèi)異癥被認(rèn)為是“良性疾病，惡性行為”，這更體現(xiàn)了它的類腫瘤性質(zhì)。在臨床工作中，內(nèi)異癥惡變的情況也并不少見，惡變的病理類型多為子宮內(nèi)膜樣癌和透明細(xì)胞癌，屬于子宮內(nèi)膜癌或者卵巢癌的范疇，在這兩類腫瘤的治療中，腹腔灌注化療占有重要位置，而在眾多的腹腔灌注化療方案中，順鉑是最常用而且療效最為明顯的一種。順鉑是細(xì)胞周期非特異性抗腫瘤藥物，進(jìn)入細(xì)

2、胞后，與DNA發(fā)生反應(yīng)，形成DNA內(nèi)兩點(diǎn)或兩鏈的交叉連接，從而抑制DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致DNA斷裂和錯(cuò)碼，抑制細(xì)胞有絲分裂，達(dá)到抗腫瘤作用。
　　芳香化酶是屬于細(xì)胞色素P450的一種復(fù)合酶，可以催化雄烯二酮和睪酮轉(zhuǎn)變成雌酮和雌二醇。動(dòng)物試驗(yàn)研究表明，在內(nèi)異癥病灶中，芳香化酶相關(guān)蛋白表達(dá)水平增高。非甾體類芳香化酶抑制劑來曲唑被研究認(rèn)為有抑制大鼠內(nèi)異癥病灶生長的作用。另有研究證明，通過持續(xù)的高劑量的來曲唑灌胃試驗(yàn)，可以通過來曲唑的芳香

3、化酶抑制劑作用誘導(dǎo)大鼠體內(nèi)的高雄激素血癥并進(jìn)而引起卵巢的多囊性改變和排卵障礙，并且動(dòng)情周期失去周期性。而在大鼠內(nèi)異癥模型治療方案的探討中，人們主要關(guān)注來曲唑灌胃治療后的內(nèi)異癥病灶的變化，同時(shí)檢測其動(dòng)情周期及卵巢內(nèi)分泌變化的研究未見報(bào)道。為彌補(bǔ)此類研究不足，本研究在研究來曲唑灌胃引起內(nèi)異癥病灶變化的同時(shí)檢測大鼠動(dòng)情周期、卵巢內(nèi)分泌及排卵的變化情況，意在探討來曲唑?qū)?nèi)異癥病灶的作用機(jī)制，究竟是直接抑制病灶中芳香化酶的表達(dá)為主要作用，還是由于

4、來曲唑引起的大鼠內(nèi)分泌的變化導(dǎo)致的體內(nèi)低雌激素狀態(tài)為主要作用。
　　分子生物學(xué)、蛋白組學(xué)和動(dòng)物模型的研究結(jié)果顯示，在動(dòng)物模型以及人類患者內(nèi)異癥病灶中MMP-2、TIMP-2和TGFb2mRNA表達(dá)水平升高。另有研究發(fā)現(xiàn)IL-1b、TNF-a、VEGF、MCP-1和PEDF在內(nèi)異癥動(dòng)物模型發(fā)病中也有重要作用。眾多的大鼠內(nèi)異癥模型研究，通過腹腔灌注治療藥物，并觀察病灶變化和檢測病灶中相關(guān)蛋白及因子的表達(dá)情況，來評(píng)價(jià)相應(yīng)的藥物療效及探索

5、可能的治療方案。
　　基于以上理論，本研究課題設(shè)計(jì)思路為通過構(gòu)建動(dòng)物模型探討可能的新的內(nèi)異癥治療方法。本實(shí)驗(yàn)選用的檢測因子指標(biāo)為：VEGF、P450arom、TGF-β和MMP-2。芳香化酶P450arom蛋白的作用如上所述，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF是內(nèi)異癥組織以及腫瘤組織在病灶生長以及轉(zhuǎn)移灶生長過程中必不可少的生長因子，它表達(dá)水平的高低直接決定了病灶的活性?；|(zhì)金屬蛋白酶MMP-2是其家族的重要成員，基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制物

6、(MMP/TIMP)是決定細(xì)胞外基質(zhì)ECM降解的主要酶系，是內(nèi)異癥病灶和腫瘤組織向周圍浸潤植入和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β也是重要的生長因子，對(duì)內(nèi)異癥病灶和腫瘤的生長起關(guān)鍵作用。
　　本研究通過手術(shù)自體子宮內(nèi)膜移植法建造大鼠內(nèi)異癥模型，評(píng)價(jià)動(dòng)物模型成功后，隨機(jī)分組進(jìn)行試驗(yàn)，通過病灶外觀觀察及病灶體積測量，組織切片病理觀察，以及異位內(nèi)膜的指標(biāo)檢測，大鼠動(dòng)情周期的動(dòng)態(tài)觀察，大鼠卵巢的形態(tài)學(xué)、組織學(xué)及免疫學(xué)變化，同時(shí)檢測大鼠

7、性激素的改變，通過和來曲唑灌胃治療的比較，來探討腹腔灌注順鉑治療內(nèi)異癥的可能療效以及來曲唑治療內(nèi)異癥的更多機(jī)制，進(jìn)一步從發(fā)病學(xué)及治療學(xué)研究內(nèi)異癥，為子宮內(nèi)膜異位癥的臨床診斷和治療提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究共分為四個(gè)部分，闡述如下。
　　目的：
　　第一部分：探討內(nèi)異癥大鼠模型的制作過程、技術(shù)要點(diǎn)及模型評(píng)價(jià)，為應(yīng)用大鼠模型進(jìn)行內(nèi)異癥藥物治療研究提供理論依據(jù)。
　　第二部分：研究應(yīng)用順鉑腹腔灌注后，對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠

8、異位內(nèi)膜病灶的作用。
　　第三部分：研究在子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型中，給予來曲唑灌胃處理后，大鼠卵巢形態(tài)、體內(nèi)性激素及卵巢功能的變化情況。
　　第四部分：研究在子宮內(nèi)膜異位癥模型中，腹腔灌注順鉑和來曲唑灌胃，對(duì)模型大鼠的異位內(nèi)膜病灶的作用，并且對(duì)二者的作用進(jìn)行比較。
　　方法與結(jié)果：
　　第一部分：45只SPF(specific-pathogen free)級(jí)雌性SD(Spraue Dawley)大鼠。隨機(jī)分為空白

9、組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，各15只。內(nèi)異癥模型應(yīng)用子宮內(nèi)膜自體移植法手術(shù)誘導(dǎo)，實(shí)驗(yàn)組移植物剝除漿膜層，對(duì)照組不剝除漿膜層，空白組僅開腹探查?？瞻捉M和實(shí)驗(yàn)組均每四日腹腔灌注生理鹽水1ml一次;對(duì)照組不給予灌注。記錄移植物的生長情況，測量并計(jì)算異位病灶的平均面積，及組織病理檢查，來評(píng)價(jià)模型成功與否。整個(gè)試驗(yàn)過程，沒有死亡和感染病例;內(nèi)異癥病灶在所有30只模型大鼠成功形成。在應(yīng)用試驗(yàn)藥物之前，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠平均異位內(nèi)膜病灶面積沒有差別。在用藥過

10、程結(jié)束后，兩組平均面積均明顯增加，但是兩組用藥結(jié)束后的平均異位內(nèi)膜病灶面積沒有差別。組織病理學(xué)觀察，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組組織評(píng)分無明顯差別;兩組的異位組織病理評(píng)分與空白組大鼠在位內(nèi)膜組織病理評(píng)分相比，差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　第二部分：應(yīng)用動(dòng)物模型，36只SD大鼠在SPF設(shè)施內(nèi)飼養(yǎng)。應(yīng)用大鼠子宮內(nèi)膜自體移植法誘導(dǎo)內(nèi)異癥模型。36只模型成功的大鼠隨機(jī)分為三組，分別為對(duì)照組、低劑量來曲唑組和高劑量來曲唑組，每組12只。對(duì)照組12只大鼠不進(jìn)行

11、藥物干預(yù);低劑量順鉑組每四天行順鉑腹腔灌注一次，劑量為35mg/m2;高劑量順鉑組每四天行順鉑腹腔灌注一次，劑量為70mg/m2;所有大鼠用藥療程共24天。測量記錄移植組織病灶的生長和病理評(píng)分。應(yīng)用免疫組化、ELISA和Western blot法檢測病灶中vascular endothelial growth factor(VEGF)，aromatase P450(P450arom),transforming growth factor

12、 beta(TGF-β),和matrix metalloprotein(MMP)-2蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果顯示，在順鉑用藥療程結(jié)束后，兩順鉑組的平均病灶面積與對(duì)照組相比均明顯降低，兩組的病灶組織病理評(píng)分也都明顯的低于對(duì)照組。與對(duì)照組相比，蛋白標(biāo)記物VEGF,P450arom，TGF-β和MMP-2的表達(dá)在兩個(gè)順鉑組均明顯降低。同時(shí)，高劑量順鉑組上述檢測指標(biāo)的變化更加明顯，表現(xiàn)出一定的劑量依賴性。另外，在高劑量順鉑組，部分大鼠表

13、現(xiàn)出脫毛現(xiàn)象。
　　第三部分：一項(xiàng)前瞻性的動(dòng)物模型研究。大鼠在SPF設(shè)施內(nèi)飼養(yǎng)。應(yīng)用SD大鼠造模。內(nèi)異癥應(yīng)用手術(shù)誘導(dǎo)法同上。對(duì)照組12只大鼠，每日應(yīng)用1ml生理鹽水灌胃;低劑量來曲唑組12只大鼠，每日以0.5mg/kg來曲唑溶液灌胃;高劑量來曲唑組12只大鼠，每日以1mg/kg來曲唑溶液灌胃;每日行陰道涂片來觀察大鼠的動(dòng)情周期變化。應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法測量大鼠血清中性激素FSH，LH，E2，T和P的濃度;應(yīng)用大體外觀觀察對(duì)比和HE染色研

14、究大鼠內(nèi)異癥病灶和卵巢的組織病理變化。研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，兩來曲唑組大鼠在用藥14天失去了規(guī)律的動(dòng)情周期變化，而且大鼠血清FSH，LH和T水平明顯升高，但是，來曲唑組的E2和P水平卻明顯低于對(duì)照組。兩來曲唑組的卵巢也呈現(xiàn)多囊性改變，排卵征象罕見。兩來曲唑組的大鼠異位內(nèi)膜病灶面積和組織病理評(píng)分也明顯的低于對(duì)照組。
　　第四部分：應(yīng)用動(dòng)物模型進(jìn)行前瞻性研究。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在SPF設(shè)施內(nèi)飼養(yǎng)，應(yīng)用SD大鼠制造動(dòng)物模型。通過大鼠內(nèi)膜組織

15、自體移植來手術(shù)誘發(fā)內(nèi)異癥模型。將30只模型大鼠隨機(jī)分為三組，每組10只。第一組作為對(duì)照組不接受藥物處理;第二組大鼠每日給予來曲唑灌胃，劑量標(biāo)準(zhǔn)為0.2mg/kg;第三組大鼠每四天行腹腔灌注順鉑一次，劑量標(biāo)準(zhǔn)為35mg/m2;所有的大鼠處理過程持續(xù)24天。對(duì)內(nèi)膜移植物病灶的生長情況和組織學(xué)評(píng)分進(jìn)行評(píng)價(jià)。應(yīng)用免疫組化法和Western blotting法檢測病灶中與組織和血管形成相關(guān)蛋白的表達(dá);大鼠血清中的性激素水平用ELISA法檢測。用藥

16、結(jié)束后，統(tǒng)計(jì)分析顯示，來曲唑組和順鉑組大鼠內(nèi)異癥病灶的生長和組織評(píng)分均明顯低于對(duì)照組;異位癥病灶中VEGF,P450arom，TGF-β和MMP-2蛋白的表達(dá)水平，在來曲唑組和順鉑組均明顯的低于對(duì)照組。另外，順鉑組中的P450arom蛋白水平明顯的低于來曲唑組;來曲唑組中的TGF-β和MMP-2蛋白水平明顯的低于順鉑組;來曲唑組大鼠血清中的T水平明顯高于順鉑組，而E2水平低于順鉑組。
　　結(jié)論：
　　1.大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模

17、型是一種易于建立和質(zhì)量可靠的動(dòng)物模型，在建造過程中要注意一些技術(shù)要點(diǎn)，傳統(tǒng)的方法和改良的方法均可滿足試驗(yàn)的要求，該模型對(duì)內(nèi)異癥的藥物治療研究有重要價(jià)值。
　　2.順鉑可以導(dǎo)致內(nèi)異癥大鼠模型異位內(nèi)膜病灶的萎縮退化，以及病灶中與組織增殖和血管生成相關(guān)的蛋白的表達(dá)水平降低，提示順鉑可能對(duì)內(nèi)異癥病人的臨床藥物治療有作用。
　　3.對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠應(yīng)用來曲唑后，大鼠在卵巢和內(nèi)分泌方面表現(xiàn)出多囊卵巢綜合征的狀態(tài)，同時(shí)，也觀察到大