eHsp90α的單克隆抗體1G6-D7對博來霉素誘導(dǎo)肺纖維化的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　肺纖維化是一種病因不明的彌漫性肺病，其預(yù)后差，發(fā)病率增長迅速。其機(jī)制尚不清楚，尋找更安全的防治靶點(diǎn)仍是難題。上皮細(xì)胞受損、持續(xù)炎癥反應(yīng)、肺成纖維細(xì)胞過度活化和遷移、膠原的病理性沉積是肺纖維化的重要進(jìn)程。其中，肺成纖維細(xì)胞功能的改變是其發(fā)生機(jī)制的研究熱點(diǎn)。
　　熱休克蛋白90(Heat Shock Protein90，Hsp90)參與組織損傷與修復(fù)，Hsp90抑制劑可改善多種器官纖維化，但其嚴(yán)重的副作用影響臨床應(yīng)用

2、。近年來發(fā)現(xiàn)，Hsp90的另一種表型，分泌型Hsp90α(eHsp90α)細(xì)胞在各種刺激下被分泌到細(xì)胞外，其與LRP-1受體結(jié)合促進(jìn)傷口愈合、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)化。但eHsp90α在肺纖維化中作用鮮有報(bào)道。本課題組具備eHsp90α的單克隆抗體1G6-D7。因此，我們旨在通過動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探索:1.eHsp90α在肺纖維化中表達(dá)、作用和機(jī)制;2.1G6-D7能否改善肺纖維化，并初步探索其作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

3、r>　　C57BL/6小鼠分為Control(Ctrl)組、BLM組、1G6-D7組、1G6-D7+BLM組。BLM組、1G6-D7+BLM組小鼠氣管內(nèi)注射BLM，Ctrl組注射等量生理鹽水;1G6-D7+BLM組、1G6-D7組滴鼻吸入1G6-D7，連續(xù)5天/周，共3周。收集血清及肺泡灌洗液，Elisa檢測血清e(cuò)Hsp90α，肺泡灌洗液eHsp90α、IL-6、IL-4、INF-γ;肺組織行H&E及Masson染色，免疫組化檢測α-S

4、MA、collagenⅠ，Western Blot檢測α-SMA、collagenⅠ、LRP-1、p-ERK/ERK、p-Akt/Akt、p-P38/P38。
　　2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　應(yīng)用含有10％胎牛血清的F-12K培養(yǎng)基對人肺成纖維細(xì)胞HFL-1進(jìn)行培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)分為ctrl組、1G6-D7組、TGF-β1組、1G6-D7+TGF-β1組。收集TGF-β1刺激HFL-1后的培養(yǎng)上清，濃縮后檢測eHsp90α;Western B

5、lot檢測α-SMA、collagenⅠ、LRP-1、p-ERK/ERK、p-Akt/Akt、p-P38/P38。
　　結(jié)果:
　　1.肺纖維化小鼠及TGF-β1的HFL-1細(xì)胞eHsp90α增加:BLM肺纖維化小鼠肺泡灌洗液及血清e(cuò)Hsp90α明顯增高。TGF-β1可誘導(dǎo)HFL-1的培養(yǎng)上清中eHsp90α增加。
　　2.1G6-D7改善BLM所致的肺部結(jié)構(gòu)破壞及膠原沉積:病理染色顯示1G6-D7可改善BLM所致肺泡

6、間隔增厚和結(jié)構(gòu)破壞，減輕炎癥細(xì)胞浸潤、抑制成纖維母細(xì)胞灶形成和膠原增生沉積。免疫組化顯示BLM使小鼠肺部表達(dá)α-SMA、collagenⅠ陽性的細(xì)胞明顯增加;Western Blot發(fā)現(xiàn)TGF-β1使HFL-1細(xì)胞表達(dá)α-SMA、collagenⅠ增加。而1G6-D7處理可抑制α-SMA、collagenⅠ的表達(dá)。
　　3.1G6-D7部分糾正BLM肺纖維化小鼠肺部炎癥因子紊亂:BLM肺纖維化小鼠的肺泡灌洗液中IL-6和IL-4增

7、高，1G6-D7處理可抑制此反應(yīng)。然而，BLM使纖維化小鼠肺泡灌洗液中INF-γ減少，1G6-D7滴鼻治療可使INF-γ的表達(dá)部分恢復(fù)。
　　4.1G6-D7調(diào)節(jié)肺纖維化信號(hào)分子的活性:BLM肺纖維化小鼠的肺組織及TGF-β1誘導(dǎo)的HFL-1細(xì)胞中LRP-1、p-Akt、p-ERK、p-P38高表達(dá)，能被1G6-D7有效抑制。
　　結(jié)論:
　　1.eHsp90α可能促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞的活化和膠原合成分泌參與肺纖維化的發(fā)生