基于線粒體的結(jié)構(gòu)和功能探討三味干姜散保肝作用及其入血成分研究.pdf

1、目的:
　　本課題從保護(hù)肝臟線粒體結(jié)構(gòu)和功能的角度出發(fā)，復(fù)制酒精性肝損傷模型和ConA免疫性肝損傷模型，探討三味干姜散的保肝機(jī)制，并研究其入血成分，為三味干姜散的臨床應(yīng)用奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.將72只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、酒精模型組、水飛薊素陽性組、三味干姜散高、中、低劑量干預(yù)組。除正常組以外，各組上午灌胃55％酒精，下午灌胃相應(yīng)藥物，連續(xù)10d，正常組灌胃相應(yīng)劑量的蒸餾水，制備酒精性肝損傷大鼠模型，在

2、末次給藥12h以后，2％戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈取血，分離的血清用于檢測肝功指標(biāo)ALT、AST，肝臟用于HE切片染色進(jìn)行病理觀察，提取的肝臟線粒體用于檢測線粒體膜電位、膜通透性、SOD、8-OHdG、呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ;制備肝勻漿檢測MDA、GSH、GSH-Px，RT-PCR檢測肝細(xì)胞中Nrf2、Bach1和HO-1 mRNA的表達(dá);Western Blot檢測肝組織中Nrf2、Bach1以及HO-1蛋白的表達(dá)水平。
　　2.將

3、72只KM小鼠隨機(jī)分為正常組、ConA模型組、水飛薊素陽性組、三味干姜散高、中、低劑量干預(yù)組。除正常組以外，各組每天灌胃相應(yīng)體積藥物1次，連續(xù)7d，正常組灌胃等體積的蒸餾水，在末次給藥以后12h，除正常組外，其余各組尾靜脈注射ConA25mg/kg，制備ConA免疫性肝損傷模型。造模4h后眼球取血，分離出的血清用于檢測肝功指標(biāo)ALT、AST，分離的肝臟用于HE切片染色進(jìn)行病理學(xué)觀察，提取的肝臟線粒體檢測線粒體膜電位、SOD、8-OHdG

4、，制備肝勻漿測定MDA、GSH、GSH-Px。
　　3.通過超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定，并建立三味干姜散化學(xué)成分信息庫，利用Peakview軟件對三味干姜散含藥血清、空白血清、單復(fù)方化合物成分進(jìn)行篩查，以6-姜酚對照品，以期尋找三味干姜散入血成分。
　　結(jié)果:
　　1.用55％酒精給SD大鼠灌胃造模10天后，發(fā)現(xiàn)酒精模型組血清中的ALT、AST水平升高（P＜0.01）;HE切片染色病理觀察結(jié)果表明，酒精模型組肝小葉之間

5、的界限不是很清晰，肝細(xì)胞索發(fā)生紊亂，肝竇范圍變窄，肝細(xì)胞也濁腫，而胞質(zhì)出現(xiàn)疏松，淡染，更有大部分的肝細(xì)胞出現(xiàn)腫脹，呈現(xiàn)出氣球樣的病變。酒精模型組的熒光強(qiáng)度比值下降，表明JC-1單體增多，膜電位△ψm下降(P＜0.05)，在10min以內(nèi)A540值迅速下降，△A540值上升明顯（P＜0.05），表明線粒體容積增大，光散射性下降。SOD酶活性顯著下降（P＜0.01），GSH-Px酶活性顯著下降(P＜0.01)，GSH活性下降(P＜0.05)

6、;MDA活性顯著增加(P＜0.01)，8-OHdG含量顯著增加（P＜0.01）;
　　2.呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ酶活性顯著性降低(P＜0.01);肝組織中的Nrf2、Bach1、HO-1 mRNA的表達(dá)水平提高，其中Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平(P＜0.05)，Bach1mRNA表達(dá)水平(P＜0.01)。三味干姜散干預(yù)組肝細(xì)胞水腫癥狀均有不同程度緩解，三昧干姜散高劑量能降低血清中ALT水平(P＜0.05)，能升高SOD酶活性(

7、P＜0.05)，升高GSH-Px酶活性(P＜0.05)，能增加GSH酶活性(P＜0.01)，10min內(nèi)△A540下降(P＜0.05)，能降低8-OHdG含量（P＜0.01），降低MDA活性(P＜0.01)，能顯著增加呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ酶活性（P＜0.01），增加呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ(P＜0.05)，能上調(diào)Nrf2和HO-1 mRNA的表達(dá)(P＜0.05);中劑量能降低血清中ALT、AST水平(P＜0.05);能增加GSH酶活性(P＜0.01)，

8、能顯著降低8-OHdG含量(P＜0.01)、降低MDA活性(P＜0.05)，能顯著增加呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ酶活性(P＜0.01);低劑量組能降低MDA活性和8-OHdG含量(P＜0.05)，增加呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ酶活性(P＜0.05)。
　　2.尾靜脈注射ConA造模后，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠血清中ALT、AST水平顯著上升(P＜0.01);HE切片染色病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，模型組的肝細(xì)胞發(fā)生水腫，有的充血壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)也受到破壞，嚴(yán)重的還出現(xiàn)小灶

9、樣壞死以及炎癥細(xì)胞浸潤，匯管區(qū)被大量炎性細(xì)胞所浸潤。模型組的熒光強(qiáng)度比值下降，表明JC-1單體可能增多，膜電位△ψm明顯下降(P＜0.05)，并且在10min以內(nèi)A540值迅速下降，△A540值明顯上升(P＜0.05)，表明線粒體容積可能增大，光散射性下降;SOD酶、GSH-Px酶活性顯著下降(P＜0.01)，GSH活性下降（P＜0.01）;MDA活性顯著增加(P＜0.05)，而8-OHdG含量卻顯著增加（P＜0.01）;在病理觀察中，

10、三味干姜散干預(yù)組對于模型組出現(xiàn)的肝細(xì)胞狀況都有著不同程度緩解，其中高劑量組能顯著降低血清中的ALT、AST的含量水平（P＜0.01），能升高SOD酶活性（P＜0.05），升高GSH-Px、GSH酶活性(P＜0.01)，能降低8-OHdG含量(P＜0.01)，降低MDA活性(P＜0.01);中劑量組的熒光強(qiáng)度比值增加，表明JC-1聚合物可能增多，膜電位△ψm明顯上升(P＜0.01)，還能增加GSH-Px酶活性（P＜0.05），能降低8-O

11、HdG含量（P＜0.01）;低劑量能升高GSH酶活性(P＜0.05)。
　　3.以6-姜酚作為對照品，對空白血清、三昧干姜散含藥血清、復(fù)方以及單方進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)6-姜酚在含藥血清、三味干姜散復(fù)方以及干姜單方中的保留時(shí)間基本一致，其在二級質(zhì)譜圖中的特征碎片峰基本一致，提示6-姜酚可能是以原型入血。
　　結(jié)論:
　　1.三味干姜散的保肝作用與其對肝臟線粒體的保護(hù)有關(guān)，具體表現(xiàn)為保護(hù)線粒體的膜結(jié)構(gòu)、提高抗氧化酶的數(shù)量，減輕D