葛根素對慢性缺血誘發(fā)的血管性癡呆大鼠認知功能障礙的保護作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　慢性腦灌注不足(CCH)可能導(dǎo)致各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病或精神疾病，CCH與學(xué)習(xí)和記憶功能障礙密切相關(guān)，尤其是血管性癡呆，表現(xiàn)為認知障礙和行為不良，CCH動物模型可以由中斷兩側(cè)頸動脈主干的大鼠制備（稱作2VO大鼠），2VO大鼠腦血流量不足導(dǎo)致大腦皮層、海馬體和白質(zhì)慢性低灌注，從而發(fā)生認知功能障礙和不良的新陳代謝，最終導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，可發(fā)生血管性癡呆。據(jù)報道稱腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）為內(nèi)環(huán)境平衡的重要調(diào)控系統(tǒng)，并被認為是治

2、療慢性腦灌注不足CCH誘發(fā)的認知功能障礙的潛在靶點。
　　血管性癡呆主要病因之一是腦血流量減少誘發(fā)的活性氧(ROS)的過度表達?；钚匝醯某磉_作為RAS過程一部分，可作為氧化應(yīng)激開始的標志，這被定義為活性氧ROS和與抗氧化反應(yīng)間平衡被打破的標志。過量的ROS和自由基會導(dǎo)致嚴重的細胞損傷，包括膜脂質(zhì)過氧化作用，DNA斷裂及損傷和蛋白質(zhì)損失，在大腦中，活性氧的過量產(chǎn)生能夠?qū)е律窠?jīng)細胞及星形膠質(zhì)細胞的死亡及細胞凋亡，從而導(dǎo)致永久性神經(jīng)損

3、傷。ROS生成和其有害影響不僅在血管性癡呆存在，也見于中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血性、出血性及再灌注條件下的病變。就這一點而言，ROS清除化合物在各種疾病模型中被廣泛測試以減少活性氧水平。
　　葛根素，一種異黃酮，可以在許多植物和草藥中發(fā)現(xiàn)，如葛根的根。葛根素也是常用于治療發(fā)燒和腹瀉的中藥。事實證明，葛根素具有清除活性氧和減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的能力。葛根素也被證明在不同種類的神經(jīng)系統(tǒng)疾病中有神經(jīng)保護作用，如阿爾茨海默氏癥，帕金森氏病和腦缺血。關(guān)

4、于葛根素的保護作用，其清除活性氧的能力是在大部分的研究中被重點提及的。一些研究還關(guān)注到葛根素在特殊的細胞類型中具有抗凋亡的活力。然而關(guān)于葛根素對血管性癡呆的保護作用目前尚無此類研究。
　　在本研究中，我們試圖通過2 VO大鼠模型驗證葛根素對慢性缺血引起的血管性癡呆具有保護作用。進一步驗證葛根素能夠減輕血管性癡呆所致的認知和行為障礙。推論葛根素在2 VO大鼠模型中的保護作用可能是通過清除ROS以減少氧化應(yīng)激反應(yīng)達到的。
　　方

5、法：
　　6到8周成年雄性Wistar大鼠作為實驗動物，經(jīng)由中斷兩側(cè)頸動脈主干制備2VO大鼠模型，給予或不給予葛根素治療。采用莫里斯水迷宮測試大鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能。丙二醇(MDA)，谷胱甘肽過氧化物酶和總硫醇評估用于反映腦組織的氧化應(yīng)激。SH-SY5Y細胞培養(yǎng)后給予過氧化氫模擬氧化應(yīng)激，給予或不給予葛根素治療，通過細胞計數(shù)Kit-8(CCK8)和流式細胞術(shù)(FCM)進行檢查細胞不同時間點及給予不同濃度葛根素治療后的生存率和凋亡率。

6、活性氧(ROS)的產(chǎn)生由2'，7'二氯熒光素二乙酸(DCFH-DA)檢驗。采用qPCR和Western blot(WB)方法測試Nrf2、FoxO1 FoxO3和FoxO4.基因表達的變化，探討葛根素的分子作用機制。
　　結(jié)果：
　　1、莫里斯水迷宮試驗中2VO組動物逃脫時間比假手術(shù)組呈現(xiàn)顯著延遲(P＜0.05)。在2VO加葛根素干預(yù)組中逃脫時間較2VO組明顯縮短，改變顯著(P＜0.05)。假手術(shù)組動物給予葛根素干預(yù)后逃脫時

7、間未見明顯改變。在目標象限花費的時間測試中，2VO模型組在目標象限區(qū)域花費的平均時間較短，與假手術(shù)組差異顯著(P＜0.05)。在2VO加葛根素干預(yù)組在目標象限區(qū)域花費的平均時間有所延長，與2VO差異顯著(P＜0.05)。假手術(shù)組動物給予葛根素干預(yù)后在目標象限區(qū)域花費的平均時間沒有任何改變。四組動物的游泳速度無顯著差異。
　　2、在2VO組海馬和額葉皮質(zhì)區(qū)的丙二醛含量較假手術(shù)組明顯提高(P＜0.05);葛根素干預(yù)組可以顯著下調(diào)海馬和

8、額葉皮層升高的MDA水平(P＜0.05);假手術(shù)組給予葛根素干預(yù)對丙二醛含量沒有任何影響。
　　2VO組的谷胱甘肽過氧化物酶濃度較假手術(shù)組較低，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);葛根素干預(yù)組顯示了葛根素對谷胱甘肽過氧化物酶濃度較大部分修復(fù)作用(P＜0.05);假手術(shù)組給予葛根素干預(yù)與假手術(shù)組比較未顯示任何差異。
　　2VO組的總硫醇濃度較假手術(shù)組顯著減少;葛根素干預(yù)組可以部分提高2VO組減少的總硫醇濃度;假手術(shù)組給予葛根素干預(yù)

9、與假手術(shù)組比較未顯示任何有統(tǒng)計學(xué)意義的變化。
　　3、以過氧化氫作為氧化應(yīng)激物刺激SH-SY5Y細胞后，給予或不給予葛根素治療均評估細胞的存活率。葛根素治療在三個不同濃度:0.1 umol/l,0.5 umol/l和1 umol/l。分別在12小時，24小時和48小時檢測細胞存活率。結(jié)果表明，過氧化氫誘發(fā)的氧化應(yīng)激在三個時間點均下調(diào)細胞的存活率。葛根素治療上調(diào)SH-SY5Y細胞的細胞存活率呈劑量依賴性。1umol/l葛根素治療組改

10、善效果最好，幾乎達到對照組的相同水平。然后我們檢測了氧化應(yīng)激后的細胞凋亡率，結(jié)果與前相反，葛根素治療降低SH-SY5Y細胞的細胞凋亡率呈劑量依賴性，1umol/l葛根素治療組改善效果最好，幾乎達到對照組相同的水平。
　　4、為了進一步探索葛根素對活性氧的清除能力，我們在SH-SY5Y細胞中通過DCFH-DA測定做ROS清除能力試驗。細胞內(nèi)ROS水平通過DCFH-DA來分析，因為DCFH-DA在細胞間具有滲透性，且對氧化敏感。給予氧

11、化氫誘導(dǎo)24小時后，培養(yǎng)基換做含有不同劑量葛根素的培養(yǎng)基。葛根素治療12小時或24小時后，通過DCFH-DA分析測定細胞內(nèi)ROS水平。DCF熒光強度的定量分析顯示給予過氧化氫誘導(dǎo)的未治療組顯示熒光水平最高。葛根素治療組的ROS陽性細胞數(shù)在12小時和24小時均顯著下調(diào)。1 umol/l濃度葛根素組與其他組比較顯示最好的活性氧清除能力(P＜0.05)。葛根素減少SH-SY5Y細胞內(nèi)DCF熒光存在明顯劑量依賴性。
　　5、通過qPCR和

12、免疫印跡進行測試Nrf2、FoxO1 FoxO3和FoxO4.基因表達的變化。結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)，雖然葛根素治療組可以顯著提高Nrf2 mRNA的表達，但過氧化氫對Nrf2的mRNA水平并沒有影響。至于FoxO家族，通過氧化氫誘導(dǎo)FoxO1 FoxO3 FoxO4提高了在mRNA水平表達。葛根素治療增強了過氧化氫的FoxO1 FoxO3 FoxO4在mRNA水平表達增高的效應(yīng)(P＜0.05)。這個結(jié)果與通過WB檢測的蛋白水平的結(jié)果是一致的。

13、WB圖像的定量分析顯示，這些抗氧化應(yīng)激基因的表達是根據(jù)mRNA水平改變情況以不同的模式被上調(diào)的。
　　結(jié)論：
　　1、研究結(jié)果表明，無論是體內(nèi)環(huán)境慢性缺血誘發(fā)的還是體外過氧化氫誘發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，葛根素干預(yù)后均可以有明顯逆轉(zhuǎn)作用。對于2VO老鼠，葛根素干預(yù)也會提高學(xué)習(xí)能力和鞏固記憶，我們發(fā)現(xiàn)葛根素的保護作用都與葛根素對ROS的清除能力密切相關(guān)，無論是慢性缺血誘發(fā)的還是體外過氧化氫誘發(fā)的反應(yīng)，此現(xiàn)象也能解釋葛根素體外試驗的抗凋

14、亡活力。在分子水平，我們發(fā)現(xiàn)葛根素的治療作用與幾種抗氧化蛋白表達相關(guān)，mRNA水平，Nrf2、FoxO1 FoxO3和FoxO4蛋白質(zhì)水平均顯著上調(diào)。還有一個有趣的發(fā)現(xiàn)，過氧化氫處理也可以上調(diào)Nrf2的表達。
　　2、我們的研究中2VO老鼠被選為體內(nèi)動物模型，雙側(cè)的頸總動脈結(jié)扎可能導(dǎo)致大腦全球缺血。兩個目標區(qū)域，即海馬和額葉皮質(zhì)，幾乎全部受到這個缺血影響，其中海馬負責學(xué)習(xí)和記憶功能。然后我們使用莫里斯水迷宮測試每組的學(xué)習(xí)和記憶功能

15、。所有結(jié)果表明葛根素對2VO老鼠受損的學(xué)習(xí)和記憶能力具有保護作用。
　　3、已經(jīng)證實氧化應(yīng)激在缺血和缺氧性腦損傷中扮演著關(guān)鍵角色。氧化應(yīng)激也與炎性細胞因子的過度表達和血管受損導(dǎo)致的認知功能障礙相關(guān)?；钚匝跄軌蜓趸づD質(zhì)，細胞蛋白質(zhì)和細胞核內(nèi)的核酸，最終導(dǎo)致細胞功能障礙。考慮到這個，我們重點關(guān)注2VO大鼠腦組織中ROS的過度生成和自由基的產(chǎn)生，我們測量了MDA的水平，這是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的一個標志。谷胱甘肽過氧化酶和硫醇含量分別測量體

16、外試驗中對抗活性氧生成的酶促和非酶促性防御反應(yīng)。為了進一步解釋葛根素在體外試驗中對ROS的清除能力，選取SH-SY5Y細胞進行培養(yǎng)，給予過氧化氫作為刺激物施加刺激，模擬體內(nèi)狀態(tài)時缺血誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激狀態(tài)。我們的結(jié)果指出葛根素治療能夠減少過氧化氫誘導(dǎo)的細胞凋亡。我們發(fā)現(xiàn)葛根素治療部分逆轉(zhuǎn)了過氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)的不利影響，呈計量依賴性。
　　4、為了探索其潛在機制，我們重點關(guān)注調(diào)控因子FOX O家族(FoxO)和Nrf2的表達。F

17、oxO家族通過提高幾種抗氧化酶的氧化還原信號的表達以減少ROS生成。FoxO家族蛋白質(zhì)也是調(diào)控細胞增殖，分化，細胞凋亡，細胞周期逮捕和自噬的轉(zhuǎn)錄因子。另一個我們關(guān)注Nrf2基因，也調(diào)節(jié)對氧化損害有保護作用的抗氧化蛋白質(zhì)。FoxO家族和Nrf2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有重要的生理功能和病理作用。我們首次報道了葛根素治療作用與上調(diào)缺血大腦中的這些基因具有相關(guān)性。總之，我們猜測葛根素對慢性腦缺血誘發(fā)的血管性癡呆具有保護作用表現(xiàn)在減輕氧化應(yīng)激和提高認知