VEGF-A與SB-431542聯(lián)合誘導SHEDs分化為Ecs的初步研究.pdf

1、目的:體外獲取和分離人脫落乳牙牙髓干細胞并采用胰酶消化、有限稀釋法對其純化，培養(yǎng)并分析干細胞干性;采用VEGF-A與SB-431542聯(lián)合誘導人脫落乳牙牙髓干細胞，初步探討其分化為內(nèi)皮細胞的高效性，為研究牙源性干細胞高效分化內(nèi)皮細胞提供一種新思路。
　　方法:
　　1、人脫落乳牙牙髓干細胞的獲取、分離、純化、培養(yǎng)及細胞干性鑒定
　　選取山東大學口腔醫(yī)學院兒牙科因滯留而拔除的健康乳前牙，在無菌狀態(tài)下獲取滯留乳牙牙髓組織，

2、并采用胰酶消化法獲取單細胞的懸液，有限稀釋法進行分離、純化。倒置顯微鏡下觀察人脫落乳牙牙髓干細胞原代、傳代細胞形態(tài)和生長狀況。流式細胞儀檢測分析CD45、CD73、CD90、CD105表面抗原陽性表達情況。選取第三代處于生長對數(shù)期的人脫落乳牙牙髓干細胞，體外成脂誘導液誘導，向脂肪組織分化。觀察細胞形態(tài)變化及胞內(nèi)成脂情況，4周后油紅-0染色。選取第三代人脫落乳牙牙髓干細胞，體外成骨誘導液誘導培養(yǎng)，第1周和第3周分別行堿性磷酸酶和茜素紅染色

3、，檢測是否有礦化結(jié)節(jié)的形成，進一步鑒定人脫落乳牙牙髓干細胞多向分化能力。
　　2、體外VEGF-A與SB-431542聯(lián)合誘導人脫落乳牙牙髓干細胞向內(nèi)皮細胞分化:將處在生長對數(shù)期的第三代人脫落乳牙牙髓干細胞以3×103個/cm2分別接種于α-MEM、VEGF-A、VEGF-A+SB-431542聯(lián)合培養(yǎng)基中，隔天更換一次培養(yǎng)液，分別提取第7天、第14天的上述細胞，RT-PCR、Western blot分別檢測三組實驗內(nèi)皮細胞相關(guān)基

4、因、蛋白表達情況。統(tǒng)計分析:所有實驗組一式三份進行，所有數(shù)值以平均值±標準偏差(SD)來表示。使用單因素方差分析確定是否具有統(tǒng)計學顯著性差異，并將具有統(tǒng)計學意義的閾值設定為P＜0.05。
　　結(jié)果:
　　1、酶消化法和有限稀釋法獲得了純的人脫落乳牙牙髓干細胞，顯微鏡下人脫落乳牙牙髓干細胞排列緊密，呈集落狀生長。流式細胞儀檢測細胞表面抗原CD45陽性檢出率為2.8％，CD73陽性檢出率為99.8％，CD90陽性檢出率為99.5

5、％，CD105陽性檢出率為94.2％。人脫落乳牙牙髓干細胞經(jīng)成脂誘導液誘導4周后，油紅-0染色陽性細胞內(nèi)呈現(xiàn)橙紅色顆粒。成骨誘導液誘導，有鈣化結(jié)節(jié)逐漸形成，茜素紅染色呈現(xiàn)橘紅色或深紅色;ALP染色細胞胞漿呈現(xiàn)均勻的藍色。
　　2、實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-qPCR)結(jié)果顯示:誘導7天、14天無論是單純的VEGF-A組還是VEGF-A+SB-431542組，均有特異性內(nèi)皮細胞分子（VEGFR-2、VEGFR-1、Ephrin

6、B2和Tie-2）的表達。誘導7天后，與單純VEGF-A組相比，用VEGF-A和SB-431542聯(lián)合培養(yǎng)的人脫落乳牙牙髓干細胞顯示出更高的VEGFR-2表達（P＜0.05)，VEGFR-1、CD31也呈現(xiàn)出相似的高表達狀態(tài)。與單獨的VEGF-A組相比，人脫落乳牙牙髓干細胞在含有VEGF-A和SB-431542培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)14天后內(nèi)皮細胞相關(guān)基因（VEGFR-2、VEGFR-1、EphrinB2和Tie-2）表達顯著增加（P＜0.0

7、5）。Western blot檢測相應蛋白的表達情況:培養(yǎng)7天和14天，VEGF-A組及VEGF-A+SB-431542組均能產(chǎn)生內(nèi)皮細胞的特異性蛋白(CD31和VEGFR-2)。但無論是第7天還是第14天，聯(lián)合組誘導分化的內(nèi)皮細胞特異性蛋白表達量均高于VEGF-A單純組。
　　結(jié)論:
　　1、體外獲取、分離并采用酶消化法和有限稀釋法可以獲得純的人脫落乳牙牙髓干細胞。流式細胞術(shù)檢測人脫落乳牙牙髓干細胞表達早期的間充質(zhì)干細胞標