超氧化物歧化酶的季銨化殼聚糖修飾及其抗結(jié)腸炎作用研究.pdf

1、活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）主要指HO·、O2-和H2O2等，是正常氧代謝的副產(chǎn)物，在細胞的增殖與分化中有舉重若輕的地位。然而，過量的ROS可引發(fā)氧化應(yīng)激(oxidative stress)反應(yīng)，最終可能導(dǎo)致一系列嚴(yán)重的疾病。其中，炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）作為臨床常見的腸道疾病，具有復(fù)發(fā)性。盡管該病的病因仍然不能完全確定，但其嚴(yán)重程度與體內(nèi)ROS

2、的水平密切相關(guān)。因此，清除體內(nèi)積累的過多的ROS被認(rèn)有是緩解IBD的可行策略。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是機體抗氧化體系的關(guān)鍵酶，將胞內(nèi)超氧陰離子歧化為氧和水是其參與的重要反應(yīng)。因此，外源SOD酶被認(rèn)為是治療ROS相關(guān)疾病的潛在治療劑。針對SOD穩(wěn)定性差、半衰期短及難以進入細胞的缺點，本課題擬在前期研究的基礎(chǔ)上，采用水溶性好的6-O-季銨化殼聚糖衍生物——6-O-2'-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖(6

3、-O-2'-hydroxylpropyltrimethyl ammonium chloride chitosan，O-HTCC)對SOD的末端羧基進行結(jié)構(gòu)修飾，純化得到O-HTCC-SOD結(jié)合物。通過測定酶活的變化比較了結(jié)合物與天然SOD在室溫下長期儲存時的穩(wěn)定性差異。利用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)建立小鼠巨噬細胞炎癥模型，ELISA試劑盒測定結(jié)合物對細胞炎癥因子分泌的影響，熒光探針DCFH-DA測定結(jié)合

4、物對細胞內(nèi)ROS水平的影響。最后，利用葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）建立小鼠急性結(jié)腸炎實驗?zāi)Ｐ停钊胩接懥私Y(jié)合物對急性結(jié)腸炎的治療效果。本學(xué)位論文取得的主成果如下:
　　1.O-HTCC-SOD的制備及性質(zhì)分析
　　通過三步化學(xué)反應(yīng)將含季銨基團的2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨(GTMAC)連接到殼聚糖C6位的羥基上，純化得到水溶性良好的6-O-季銨化殼聚糖衍生物（命名為O-HTCC），產(chǎn)率

5、達到81.2％，IR和1HNMR確定了結(jié)構(gòu)的正確性。使用茚三酮比色法測定自由氨基含量，得到的O-HTCC的自由氨基率高達71.5％。 SOD的末端羧基經(jīng)碳二亞胺N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)活化后，與O-HTCC的自由氨基形成酰胺鍵得到修飾產(chǎn)物O-HTCC-SOD，修飾率超過70％。經(jīng)弱陰離交換柱層析純化得到結(jié)合物精品。純化組分通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳驗證，分析表明修飾產(chǎn)物的分子量明顯增大，且為連續(xù)分布的多組分。連續(xù)測定初始

6、酶活相同的天然SOD與O-HTCC-SOD在室溫下的酶活保留率，結(jié)果表明，室溫下存放30 d后結(jié)合物的酶活保留率高達86.8％，而SOD僅為44.1％。因此，O-HTCC-SOD在室溫條件下的長期穩(wěn)定性顯著高于未修飾的SOD，有利于SOD酶的長期儲存。
　　2.O-HTCC-SOD的體外抗炎作用評價
　　淀粉肉湯法收集得到小鼠腹腔巨噬細胞，MTT比色法測定O-HTCC-SOD對細胞的毒性，結(jié)果表明:在劑量范圍為10U/mL～

7、1250 U/mL時，O-HTCC-SOD與SOD均未表現(xiàn)明顯的細胞毒性。利用LPS刺激小鼠腹腔巨噬細胞，建立體外炎癥模型。通過ELISA試劑盒測定，發(fā)現(xiàn)O-HTCC-SOD與SOD均能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的細胞炎癥因子，如TNF-α、IL-6、IL-1β的產(chǎn)生，但未表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，提示其作用源于SOD酶的催化活性。巨噬細胞經(jīng)O-HTCC-SOD或天然SOD預(yù)處理后，與LPS共同孵育6h，，然后裝載熒光探針DCFH-DA，測定細

8、胞內(nèi)的ROS水平，結(jié)果表明:O-HTCC-SOD預(yù)處理的細胞的ROS水平顯著低于模型組(P＜0.01); SOD組的ROS水平則未有顯著下降（P＞0.05）。這一結(jié)果表明，O-HTCC修飾的SOD入胞能力增強，從而提高了SOD的清除胞內(nèi)ROS的能力。
　　3.O-HTCC-SOD對DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的防護作用評價
　　通過使BALB/c小鼠口服5％葡聚糖硫酸鈉(DSS)建立急性結(jié)腸炎模型，尾靜脈注射不同劑量的O-HTCC

9、-SOD，深入研究其抗炎作用，并比較O-HTCC-SOD、未修飾的SOD、O-HTCC與SOD的混合物的治療效果的差異。結(jié)果顯示:連續(xù)5天自由飲用5％的DSS可使小鼠表現(xiàn)出典型的急性結(jié)腸炎癥狀，包括體重明顯下降，疾病活動指數(shù)(disease activity index，DAI)顯著升高，結(jié)腸長度大大縮短，結(jié)腸組織的髓過氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)水平顯著升高。并且，結(jié)腸病理切片觀察發(fā)現(xiàn)明顯的結(jié)腸部位損傷，例如上皮

10、和杯狀細胞損失、隱窩病變和大面積的炎性細胞浸潤。與模型組相比，O-HTCC-SOD顯著抑制了DSS導(dǎo)致的體重下降、DAI升高、結(jié)腸長度縮短及MPO活性升高(P＜0.01)，并大大減輕DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸病理學(xué)損傷。相比之下，天然SOD及其與O-HTCC的混合物除能在一定程度上抑制DAI和MPO活性升高(P＜0.05)外，對結(jié)腸長度縮短、病理學(xué)改變等癥狀未能表現(xiàn)出明顯改善（P＞0.05）。因此，與天然SOD相比，經(jīng)O-HTCC修飾得到的O-H

11、TCC-SOD治療DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的效果顯著增強。此外，O-HTCC-SOD對結(jié)腸炎的體內(nèi)量效關(guān)系研究表明:不同劑量(1.5 kU/kg～6.0 kU/kg)結(jié)合物均能顯著抑制DSS導(dǎo)致的DAI升高(P＜0.05)，但未呈明顯的劑量依賴性;劑量為3.0 kU/kg時對結(jié)腸縮短抑制作用最佳;劑量為3.0～4.5 kU/kg時，對MPO水平抑制作用最佳?？傊琌-HTCC-SOD在劑量為3.0 kU/kg時，對DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎具有最

12、佳的治療效果。
　　4.O-HTCC-SOD的免疫原性
　　本文選用以SOD和O-HTCC-SOD為免疫原對BALB/c小鼠進行免疫。第一次免疫兩周后，進行第二次免疫，再隔兩周，摘眼球取血得到血清，用間接ELISA法檢測各組小鼠血清中的IgG水平。O-HTCC-SOD的免疫效價明顯較未修飾的SOD低。
　　綜上所述，SOD經(jīng)殼聚糖的衍生物O-HTCC修飾，得到的結(jié)合物O-HTCC-SOD在室溫下長期保存時，穩(wěn)定性顯著提