樹(shù)莓超氧化物歧化酶的提純、化學(xué)修飾與固定化的研究.pdf

1、超氧化物歧化酶是體內(nèi)自由基主要清除劑之一，簡(jiǎn)稱(chēng)為SOD?，F(xiàn)已證明樹(shù)莓是富含SOD的水果資源。本文以樹(shù)莓為原料，通過(guò)鹽析、凝膠層析、離子交換和金屬螯合親和層析等步驟對(duì)樹(shù)莓SOD進(jìn)行純化，對(duì)其部分性質(zhì)進(jìn)行研究。然后針對(duì)SOD作為藥用酶的缺陷，對(duì)樹(shù)莓SOD進(jìn)行了化學(xué)修飾與固定化研究。這些為樹(shù)莓SOD的進(jìn)一步深入研究及其在藥品、保健食品和化妝品的應(yīng)用打下了一定基礎(chǔ)。本試驗(yàn)主要結(jié)果如下： 第一，對(duì)抽提緩沖液的pH值、抽提體積和抽提次數(shù)進(jìn)行

2、優(yōu)化，得出最佳的抽提條件：pH值為7.8，抽提體積為1.5倍，抽提次數(shù)為2次。同時(shí)，通過(guò)(NH<,4>)<,2>SO<,4>鹽析沉淀實(shí)現(xiàn)分級(jí)分離，考察了不同(NH<,4>)<,2>SO<,4>飽和度沉淀的酶活力，得出(NH<,4>)<,2>SO<,4>飽和度為50％～90％時(shí)，能夠達(dá)到最大酶活。 第二，利用凝膠層析初步純化樹(shù)莓SOI)。純化條件：柱體1.6cm×60cm；磷酸鹽緩沖液pH7.8、2.5mmol/L；流速0.3mL

3、/min；每管收集3.0mL。經(jīng)過(guò)SephadexG.100層析分離純化得到3種SOD同工酶。分別通過(guò)DEAE-52層析和金屬螯合親和層析進(jìn)一步對(duì)樹(shù)莓SOD純化，并比較兩者純化效果。DEAE-52層析純化條件：柱體2.6cmx60cm；梯度洗脫液pH7.8、2.5mmol/L(250mL)～200mmol/L(250mL)磷酸鹽緩沖液；流速0.7m12min；每管收集3.5mL。金屬螯合親和層析純化條件：柱體1.0cmx40cm；離子載

4、體0.1mol/LCuSO<,4>；檸檬酸緩沖液pH5.0、0.1mol/L；流速0.5mL/min；每管收集5mL。通過(guò)比較得出，金屬螯合親和層析比DEAE-52層析純化SOD的回收率高20.4％，相對(duì)應(yīng)的純化倍數(shù)高119.4，因此金屬螯合親和層析更有利于SOD的進(jìn)一步純化。 第三，利用SOD活性染色和SDS.PAGE電泳進(jìn)行純度鑒定和亞基分子量測(cè)定。3種SOD均達(dá)到電泳純；3種SOD的亞基分子量分別為：SOD Ⅰ為24000

5、D，SODⅡ?yàn)?2000D，SODⅢ為18000D。并對(duì)樹(shù)莓SOD的理化性質(zhì)進(jìn)行研究，即SOD敏感性試驗(yàn)，最大紫外吸收峰和溫度、pH值、離子強(qiáng)度及金屬離子等因素對(duì)SOD的影響。3種酶最大紫外吸收峰均為280nm；均對(duì)：KCN和H<,2>O<,2>不敏感，說(shuō)明這3種酶都屬于Mn-SOD；SOD具有較好的溫度穩(wěn)定性，最適溫度為40℃；在pH7.0～9.0范圍內(nèi)SOD相對(duì)酶活力較高，保持在80％左右，pH過(guò)高或過(guò)低SOD均易失活；3種SOD受

6、離子強(qiáng)度的影響較小，金屬離子Al<'3+>、Cu<'2+>、Mg<'2+>、K<'+>、Ca<'2+>、Zn<'2+>具有一定程度的激活作用，而pb<'2+>、Fe<'3+>、Sn<'2+>則具有非常明顯的抑制作用。 第四，應(yīng)用4種氧化降解法，主要包括：H<,2>O<,2>法、HAC-H<,2>O<,2>法、H<,2>O<,2>-NaClO法和NaBO<,3>法，在優(yōu)化條件下制備了4種低聚水溶性殼聚糖。用4種低聚水溶性殼聚糖對(duì)樹(shù)

7、莓SOD進(jìn)行化學(xué)修飾，H<,2>O<,2>法制備的低聚水溶性殼聚糖作為修飾劑得到的修飾酶總活力較高，可達(dá)到712.38 U/mL。SOD經(jīng)H<,2>O<,2>法制備的低聚水溶性殼聚糖修飾后，SOD氨基修飾率為59.27％，SOD活性保持率為63.12％。修飾SOD的溫度穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性均明顯提高，同時(shí)與天然SOD相比，修飾SOD的木瓜蛋白酶酶切耐受性明顯增強(qiáng)。修飾酶的體外半衰期486.71h，天然酶的體外半衰期為94.27h，修飾酶的

8、體外半衰期較天然酶體外半衰期延長(zhǎng)了4倍。結(jié)果表明，低聚水溶性殼聚糖修飾SOD是可行的，并可作為一種較好的修飾SOD的化學(xué)修飾劑。 第五，本文對(duì)殼聚糖采取不同處理方法，對(duì)樹(shù)莓SOD進(jìn)行固定化，篩選出了較優(yōu)的殼聚糖載體的制備方法，確定了殼聚糖粉固定化SOD制備的條件，并考察固定化SOD的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明，以殼聚糖為載體，戊二醛交聯(lián)法制備固定化SOD，優(yōu)化條件下活化中戊二醛濃度取0.4％制備的固定化酶，所得殼聚糖酶粉活力為192U/