樹莓超氧化物歧化酶的提純、化學修飾與固定化的研究.pdf

1、超氧化物歧化酶是體內(nèi)自由基主要清除劑之一，簡稱為SOD?，F(xiàn)已證明樹莓是富含SOD的水果資源。本文以樹莓為原料，通過鹽析、凝膠層析、離子交換和金屬螯合親和層析等步驟對樹莓SOD進行純化，對其部分性質(zhì)進行研究。然后針對SOD作為藥用酶的缺陷，對樹莓SOD進行了化學修飾與固定化研究。這些為樹莓SOD的進一步深入研究及其在藥品、保健食品和化妝品的應用打下了一定基礎。本試驗主要結果如下： 第一，對抽提緩沖液的pH值、抽提體積和抽提次數(shù)進行

2、優(yōu)化，得出最佳的抽提條件：pH值為7.8，抽提體積為1.5倍，抽提次數(shù)為2次。同時，通過(NH<,4>)<,2>SO<,4>鹽析沉淀實現(xiàn)分級分離，考察了不同(NH<,4>)<,2>SO<,4>飽和度沉淀的酶活力，得出(NH<,4>)<,2>SO<,4>飽和度為50％～90％時，能夠達到最大酶活。 第二，利用凝膠層析初步純化樹莓SOI)。純化條件：柱體1.6cm×60cm；磷酸鹽緩沖液pH7.8、2.5mmol/L；流速0.3mL

3、/min；每管收集3.0mL。經(jīng)過SephadexG.100層析分離純化得到3種SOD同工酶。分別通過DEAE-52層析和金屬螯合親和層析進一步對樹莓SOD純化，并比較兩者純化效果。DEAE-52層析純化條件：柱體2.6cmx60cm；梯度洗脫液pH7.8、2.5mmol/L(250mL)～200mmol/L(250mL)磷酸鹽緩沖液；流速0.7m12min；每管收集3.5mL。金屬螯合親和層析純化條件：柱體1.0cmx40cm；離子載

4、體0.1mol/LCuSO<,4>；檸檬酸緩沖液pH5.0、0.1mol/L；流速0.5mL/min；每管收集5mL。通過比較得出，金屬螯合親和層析比DEAE-52層析純化SOD的回收率高20.4％，相對應的純化倍數(shù)高119.4，因此金屬螯合親和層析更有利于SOD的進一步純化。 第三，利用SOD活性染色和SDS.PAGE電泳進行純度鑒定和亞基分子量測定。3種SOD均達到電泳純；3種SOD的亞基分子量分別為：SOD Ⅰ為24000

5、D，SODⅡ為22000D，SODⅢ為18000D。并對樹莓SOD的理化性質(zhì)進行研究，即SOD敏感性試驗，最大紫外吸收峰和溫度、pH值、離子強度及金屬離子等因素對SOD的影響。3種酶最大紫外吸收峰均為280nm；均對：KCN和H<,2>O<,2>不敏感，說明這3種酶都屬于Mn-SOD；SOD具有較好的溫度穩(wěn)定性，最適溫度為40℃；在pH7.0～9.0范圍內(nèi)SOD相對酶活力較高，保持在80％左右，pH過高或過低SOD均易失活；3種SOD受

6、離子強度的影響較小，金屬離子Al<'3+>、Cu<'2+>、Mg<'2+>、K<'+>、Ca<'2+>、Zn<'2+>具有一定程度的激活作用，而pb<'2+>、Fe<'3+>、Sn<'2+>則具有非常明顯的抑制作用。 第四，應用4種氧化降解法，主要包括：H<,2>O<,2>法、HAC-H<,2>O<,2>法、H<,2>O<,2>-NaClO法和NaBO<,3>法，在優(yōu)化條件下制備了4種低聚水溶性殼聚糖。用4種低聚水溶性殼聚糖對樹

7、莓SOD進行化學修飾，H<,2>O<,2>法制備的低聚水溶性殼聚糖作為修飾劑得到的修飾酶總活力較高，可達到712.38 U/mL。SOD經(jīng)H<,2>O<,2>法制備的低聚水溶性殼聚糖修飾后，SOD氨基修飾率為59.27％，SOD活性保持率為63.12％。修飾SOD的溫度穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性均明顯提高，同時與天然SOD相比，修飾SOD的木瓜蛋白酶酶切耐受性明顯增強。修飾酶的體外半衰期486.71h，天然酶的體外半衰期為94.27h，修飾酶的

8、體外半衰期較天然酶體外半衰期延長了4倍。結果表明，低聚水溶性殼聚糖修飾SOD是可行的，并可作為一種較好的修飾SOD的化學修飾劑。 第五，本文對殼聚糖采取不同處理方法，對樹莓SOD進行固定化，篩選出了較優(yōu)的殼聚糖載體的制備方法，確定了殼聚糖粉固定化SOD制備的條件，并考察固定化SOD的酶學性質(zhì)。結果表明，以殼聚糖為載體，戊二醛交聯(lián)法制備固定化SOD，優(yōu)化條件下活化中戊二醛濃度取0.4％制備的固定化酶，所得殼聚糖酶粉活力為192U/