小膠質(zhì)細(xì)胞在熱射病小鼠早期中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥發(fā)生中的作用研究.pdf

1、目的：
　　熱射病(heat stroke：HS)，即重癥中暑，是一種常見的急癥。主要表現(xiàn)為體溫急劇升高，超過40℃，皮膚出現(xiàn)干燥和灼熱，伴有明顯中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損癥狀。重癥患者若未能及時有效控制，則迅速發(fā)展為全身多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS），死亡率可達(dá)30-50％。近年來，因全球氣候變暖，我國軍人在熱區(qū)進(jìn)行訓(xùn)練、野戰(zhàn)演習(xí)和執(zhí)行任務(wù)時中暑的發(fā)生率明顯增加，往

2、往由于部隊(duì)訓(xùn)練及執(zhí)行任務(wù)的地區(qū)條件較艱苦，醫(yī)療水平較為落后，故死亡率更高。因此研究熱射病發(fā)生機(jī)理，探索新的治療策略和措施，提高熱射病的救治成功率，對維護(hù)軍人以及特殊職業(yè)人群的身體健康，保障部隊(duì)的戰(zhàn)斗力具有重要的作用和意義。
　　中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的發(fā)生及發(fā)展與小膠質(zhì)細(xì)胞密切相關(guān)。小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起到營養(yǎng)、支持、抗原遞呈和組織修護(hù)等作用，也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫反應(yīng)的主要介質(zhì)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病理和

3、生理過程中起到至關(guān)重要的作用。小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥中具有雙重作用。
　　因此，本課題通過建立小鼠熱射病模型，觀察小膠質(zhì)細(xì)胞在熱射病小鼠早期中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥發(fā)生的變化，研究熱射病小鼠腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞活化表型的變化情況，并采用離體細(xì)胞模型初步探討熱射病過程中影響小膠質(zhì)細(xì)胞活化表型變化的因素，以揭示小膠質(zhì)細(xì)胞在熱射病中導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)中的作用，為以后臨床上通過采用調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞活化來救治熱射病提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。
　

4、　方法:
　　1、采用12周齡的BALB/c12健康雄性小鼠，重量為（29.1±0.6）g，小鼠置于高溫環(huán)境智能模擬實(shí)驗(yàn)艙，溫度（41.2±0.5）℃，相對濕度（60±2）％，加熱至直腸溫度達(dá)到（42.4±0.2）℃建立熱射病小鼠模型。將小鼠隨機(jī)分為正常對照組(CON)，熱射病組(HS)，熱射病組又分為熱射病1h組(HS-1h)、熱射病3h組(HS-3h)、熱射病6h組(HS-6h)、熱射病12h組(HS-12h)、熱射病24h組

5、(HS-24h)。對比觀察艙室內(nèi)及出艙后Tre變化和生存率情況，以及不同熱射病組小鼠體質(zhì)量的變化，利用HE染色觀察大腦組織病理變化。通過實(shí)時定量熒光PCR(quantitative rea1-timePCR，qPCR)和酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測各組小鼠大腦皮層及海馬TNF-α、IL-1β和IL-6基因及蛋白表達(dá)，探討熱射病后各恢復(fù)時相點(diǎn)大腦炎癥的變化情況。

6、r>　　2、通過qPCR檢測各組小鼠大腦皮層M1極性活化標(biāo)志物CD45、CD16和CD11bmRNA和M2極性活化標(biāo)志物Arg1（Arginase1，精氨酸酶）、FIZZ(found in inflammatory zone，發(fā)現(xiàn)于炎癥區(qū)域)和CD206mRNA的相對表達(dá)水平。Western Blot檢測各組小鼠大腦皮層M1極性活化標(biāo)志物蛋白CD45、CD11b和M2極性活化標(biāo)志物蛋白FIZZ、CD206的表達(dá)水平。免疫組織熒光觀察M1

7、極性活化標(biāo)志物CD45和M2極性活化標(biāo)志物CD206表達(dá)情況，探討熱射病后不同時間點(diǎn)大腦皮層小膠質(zhì)細(xì)胞活化表型的表達(dá)規(guī)律。
　　3、通過體外培養(yǎng)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞以及BV-2與PC12神經(jīng)細(xì)胞transwell共培養(yǎng)的細(xì)胞模型，采用熱應(yīng)激及脂多糖(LPS)刺激，采用ELSA檢測各種條件下培養(yǎng)液中炎癥因子TNF-α、IL-1β的濃度，明確熱應(yīng)激后小膠質(zhì)細(xì)胞促炎反應(yīng)的規(guī)律。用q-PCR、流式細(xì)胞術(shù)以及免疫組織熒光標(biāo)記觀察各種條件和刺激

8、模型中BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞M1極性活化標(biāo)志物CD11b、CD45和M2極性活化標(biāo)志物FIZZ、CD206mRNA、蛋白質(zhì)表達(dá)量在不同時間點(diǎn)的相對表達(dá)水平揭示熱應(yīng)激及LPS對單獨(dú)或共培養(yǎng)條件下BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞活化表型的影響，初步探討對熱射病過程中觸發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的主要機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1、在（41.2±0.5）℃、濕度(60±2)％環(huán)境中持續(xù)暴露至小鼠Tre達(dá)（42.4±0.2）℃建立了小鼠熱射病模型。出艙后HS-1h

9、組小鼠Tre體溫明顯降低，表現(xiàn)為低體溫期，HS-24h組小鼠Tre略高于CON組，表現(xiàn)為發(fā)熱期;HE染色觀察到在熱射病后恢復(fù)1h小鼠觀察到細(xì)胞周圍水腫、血管周圍水腫、細(xì)胞核固縮裂解、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)紊亂等，其后隨時間延長損傷程度逐步減輕。表明熱應(yīng)激導(dǎo)致小鼠中樞神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯病理變化，熱射病中樞神經(jīng)損傷小鼠模型成功建立。HS-1h組、HS-3h組小鼠大腦皮層和海馬炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的基因表達(dá)及蛋白合成明顯增多，與CON組比較

10、差異明顯(P＜0.0001)，HS-24h組小鼠大腦皮層和海馬炎癥因子與CON組無明顯差異(P＞0.05)。提示熱射病恢復(fù)期內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有明顯炎癥反應(yīng)，以恢復(fù)期1h最為嚴(yán)重，到24h后基本恢復(fù)正常水平。
　　2、熱射病小鼠大腦皮層M1極性活化標(biāo)志物CD45、CD16和CD11b的mRNA表達(dá)水平在熱射病恢復(fù)后1h迅速升高(P＜0.01)，到24h后mRNA表達(dá)水平基本恢復(fù)至CON組水平(P＞0.05)。小鼠大腦皮層M2極性活化標(biāo)

11、志物Arg1、FIZZ和CD206的mRNA表達(dá)水平在熱射病恢復(fù)3h開始明顯增加(P＜0.001)，后隨時間延長逐漸升高，到24h后達(dá)到最高(P＜0.0001)。皮層M1及M2極性活化標(biāo)志物蛋白表達(dá)水平基本與mRNA表達(dá)的變化規(guī)律相似。免疫組織熒光觀察M1極性活化標(biāo)志物CD45，熱射病后恢復(fù)1h標(biāo)記明顯，M2極性活化標(biāo)志物CD206在熱射病后恢復(fù)24h標(biāo)記明顯。
　　3、熱應(yīng)激刺激BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞后，檢測到到炎癥因子TNF-α、

12、IL-1β含量明顯升高(P＜0.0001)，后逐漸降低，24h后仍然高于對照組(P＜0.0001)。熱刺激后1-3h BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞M1極性活化標(biāo)志物CD45、CD11b mRNA表達(dá)水平顯著高于對照(P＜0.0001)，其后略有下降，24h仍維持高表達(dá)水平(P＜0.01);而M2標(biāo)志物CD206、FIZZ mRNA相對表達(dá)水平在熱應(yīng)激后3h出現(xiàn)表達(dá)高峰(P＜0.01)，其它時相組與對照無明顯差異(P＞0.05)。流式細(xì)胞檢測M1及

13、M2標(biāo)志物CD45與CD206蛋白質(zhì)在熱應(yīng)激1h與24h的表達(dá)，結(jié)果基本與mRNA相似。免疫熒光觀察到CD45在恢復(fù)1h表達(dá)增多，至24h基本降低至CON組水平，CD206在恢復(fù)1h至24h基本無明顯變化。BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞與PC12神經(jīng)細(xì)胞transwell共培養(yǎng)的細(xì)胞模型，觀察發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激后小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化標(biāo)志物CD45、CD11bmRNA相對表達(dá)水平在1h時表達(dá)最高(P＜0.0001)，之后逐漸下降，24h后與對照無明顯差異(P＞

14、0.05)。M2極化標(biāo)志物FIZZ、CD206mRNA相對表達(dá)水平的表達(dá)量在在熱應(yīng)激3-6h開始升高，到24h達(dá)到最高(P＜0.0001);流式細(xì)胞術(shù)檢測M1極化標(biāo)志物CD45與的M2極化標(biāo)志物CD206蛋白表達(dá)量，其變化趨勢與mRNA基本一致。免疫熒光觀察CD45在恢復(fù)1h時少量增加，恢復(fù)至24h時降至CON組水平。CD206在恢復(fù)1h變化不明顯，恢復(fù)至24h增加顯著。LPS刺激后1-3h BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化標(biāo)志物CD45、C

15、D11bmRNA表達(dá)水平明顯升高(P＜0.0001)，24h后達(dá)到峰值(P＜0.0001);M2極化標(biāo)志物CD206在刺激后1-12h變化與對照組比較無明顯差異，M2極化標(biāo)志物FIZZmRNA相對表達(dá)水平在LPS刺激后1-3h變化不明顯，6h-24h反而明顯低于對照組。流式細(xì)胞術(shù)檢測M1極化標(biāo)志物CD45及M2標(biāo)志物CD206蛋白質(zhì)在熱應(yīng)激1h與24h的表達(dá)，結(jié)果與mRNA表達(dá)變化基本相似。免疫熒光觀察到CD45持續(xù)增加，至24h達(dá)到最

16、高。CD206在1h無明顯變化，至24h降低。
　　結(jié)論:
　　1、熱射病后恢復(fù)期1h-3h內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，病理損傷最重，之后隨著時間延長逐漸減輕，至24h基本趨于恢復(fù)，提示中樞神經(jīng)炎癥與熱射病中樞神經(jīng)損傷密切相關(guān)。
　　2、熱射病可誘導(dǎo)小鼠腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞活化，其活化的規(guī)律表現(xiàn)為熱射病后1h-3h主要表現(xiàn)為M1型極化，而在熱射病后24h則主要表現(xiàn)為M2型極化，結(jié)果表明熱射病后小膠質(zhì)細(xì)胞由M1型向M2