慢性腎衰去細胞支架結(jié)構(gòu)成分的分析.pdf

1、目的：據(jù)統(tǒng)計，全球每一萬人口中，就約有1~1.5人會發(fā)生慢性腎衰竭，由于長期血液透析費用高昂，且副作用較多，讓一般家庭難以承受。終末期腎衰竭是威脅生命的嚴重疾病，腎臟移植是提高終末期腎病患者生存率、改善患者生活質(zhì)量的最佳治療手段。組織工程學]的發(fā)展，為自體組織工程移植帶來了新的希望。2008年，Harald C Ott等學者成功地對心臟進行去細胞處理。隨后Nakayama KH等學者通過去垢劑浸泡法制備了猴子的腎臟去細胞支架；劉春曉、潘

2、明新等學者采用化學去垢劑胰酶聯(lián)合法制備了去細胞全腎臟以及肝臟生物支架（DLBS）。2013年，Jeremy J Song等成功培養(yǎng)出去細胞支架誘導(dǎo)分化的大鼠供體腎臟，并將組織工程腎成功移植到大鼠身上。大量研究結(jié)果表明，全腎的去細胞支架種植自體干細胞誘導(dǎo)分化成完整腎臟是一個潛在的可利用的器官移植源。然而目前的研究多局限于正常生理狀態(tài)下的器官，對病理狀態(tài)下的器官并未進行過多研究，但是臨床上捐獻的腎臟又多來自于老年人或者有腎臟病變的人。所以本

3、實驗旨在通過對慢腎衰模型大鼠腎臟去細胞方法的探索，對比健康大鼠腎臟細胞外基質(zhì)在結(jié)構(gòu)、成分上的改變，為進一步探索病理狀態(tài)下腎臟的復(fù)細胞化打下基礎(chǔ)。
　　方法：⑴制備慢性腎衰模型并對模型進行檢測。分組及模型制備：選取體重相近（200g）的CL級雌性 SD大鼠共48只。隨機平均分成對照組與實驗組。實驗組以文獻報道的腺嘌呤灌胃給藥法制備腎衰模型。慢性腎衰去細胞腎臟支架的制備：以本課題組前期文獻報道的去污劑灌注法制備腎衰腎臟去細胞支架。形態(tài)

4、學檢測：包括蘇木精-伊紅染色（HE），Masson染色，PAS染色和掃描電鏡觀察。⑵按組織免疫熒光的方法檢測Ln、膠原蛋白I、膠原蛋白IV，VEGF，α-SMA。ELISA酶聯(lián)免疫吸附測定：檢測HGF、FGF-2、VEGF、PDGF-BB、TGF-β。iTRAQ/TMT高通量蛋白質(zhì)組學研究:慢性腎衰腎臟去細胞支架為實驗組，正常腎臟去細胞支架為對照組。通過將iTRAQ/TMT穩(wěn)定同位素標記技術(shù)，高效液相色譜分級技術(shù)，對樣品進行高通量蛋白質(zhì)

5、組學研究。⑶EPCs的提取:取220gSD大鼠股骨與脛骨用差速離心法提取EPCs。EPCs的鑒定：采用免疫熒光的方法進行鑒定，用KDR和CD133雙標并用DAPI染核。共培養(yǎng)：cck8法檢測共培養(yǎng)1d,3d,5d,7d后細胞的增殖與凋亡。并對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。
　　結(jié)果：①慢腎衰腎臟表面出現(xiàn)斑點狀改變，腎臟體積增大。經(jīng)PBS沖洗凈殘余血液后，即呈現(xiàn)乳白色偏黃不透明外觀，之后基本一直保持乳白色外觀。而健康腎臟在沖凈殘余血液后，呈現(xiàn)

6、一種土黃色。腎功能檢測：慢性腎衰大鼠血清CREA，BUN明顯升高（P＜0.01,）。HE鏡下對比觀測：慢性腎衰腎臟鏡下明顯可見腎小管形變且可見腺嘌吟代謝結(jié)晶堆積于小管區(qū)，腎小球內(nèi)出現(xiàn)空泡。正常腎臟去細胞支架呈現(xiàn)疏松帶狀，管腔大小較為一致的細胞外基質(zhì)而慢性腎衰腎臟去細胞支架呈現(xiàn)為致密的線狀，尤其是在結(jié)晶周圍。Masson鏡下對比觀測：正常腎臟細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，管腔大小相似，且染色的顏色較淡；而腎衰腎臟的細胞外基質(zhì)大量藍色纖維物質(zhì)沉積，表

7、示細胞外基質(zhì)增生明顯，形成較為致密的基質(zhì)條帶，染色較深，尤其是在結(jié)晶周邊。PAS鏡下對比觀測：明顯可見慢性腎衰腎臟及其去細胞支架系膜區(qū)增寬，系膜細胞及系膜基質(zhì)均有增生，基底膜增厚。掃描電鏡：正常腎臟的細胞質(zhì)外基質(zhì)：管腔圓潤且管腔外基質(zhì)厚度均勻，管腔邊緣光滑，大小相近三維結(jié)構(gòu)十分規(guī)整；而慢性腎衰腎臟的細胞質(zhì)外基質(zhì)則棱角明顯且有粗糙感，三維結(jié)構(gòu)紊亂，并且在結(jié)晶周圍細胞質(zhì)外基質(zhì)厚度明顯比其余地方更厚，而且結(jié)晶周圍的基質(zhì)增生最明顯。②對比檢測慢

8、性腎衰腎臟去細胞支架和正常腎臟去細胞支架中的蛋白：免疫熒光：慢性腎衰腎臟及其去細胞支架熒光顯微鏡下I型膠原蛋白、IV型膠原蛋白、VEGF、α-SMA和Ln均可見增生。ELISA酶聯(lián)免疫吸附測定：正常組和腎衰組都沒有顯著差異；腎衰組和腎衰支架組都沒有顯著差異；正常組和正常支架組都有顯著差異；除了PDGF-BB，正常支架組和腎衰支架組組間沒有顯著差異。iTRAQ/TMT高通量蛋白質(zhì)組學研究:慢性腎衰腎臟去細胞支架為實驗組，正常腎臟去細胞支架

9、為對照組：細胞質(zhì)外基質(zhì)：同種蛋白占1.59％，異種蛋白占1.34%；分泌蛋白：同種蛋白占4.47%，異種蛋白占7.59%；細胞骨架：同種蛋白占4.80%，異種蛋白占4.46%；細胞核：同種蛋白占10.71%，異種蛋白占8.04%；胞質(zhì)：同種蛋白占1.56%，異種蛋白占2.23%；細胞膜：同種蛋白占25.54%，異種蛋白占33.48%。③慢性腎衰腎臟去細胞支架和正常腎臟去細胞支架與EPCs體外共培養(yǎng)：EPCs的提取：培養(yǎng)一周后可見有三角形

10、的細胞貼壁。內(nèi)皮祖細胞的鑒定：結(jié)果雙陽性，證明所提取的細胞是內(nèi)皮祖細胞。共培養(yǎng)：根據(jù)標準曲線以及酶標儀測定的數(shù)據(jù)計算出每孔所含有的細胞數(shù)，采用雙因素方差分析：正常組和慢性腎衰組組和空白對照組細胞增殖有顯著差異，各組在不同時間點的細胞增殖也有顯著差異。
　　結(jié)論：實驗組大鼠血清CREA，BUN明顯升高說明造模成功[16]，慢性腎衰腎臟表面出現(xiàn)斑點狀改變，且腎臟體積有所增大，外觀顏色也變?yōu)槠S的乳白色，而且慢性腎衰腎臟支架與正常腎臟支