乙肝病毒基因突變與基因組多樣性和疾病關聯(lián)性研究.pdf

1、在我國，HBV慢性感染是導致肝硬化、肝癌發(fā)生的重要誘因。研究發(fā)現(xiàn)HBV的基因型可能與疾病的臨床表現(xiàn)密切相關，而HBV基因的突變與肝炎的治療失敗和肝癌的發(fā)生密切相關。因此，通過對乙肝患者進行HBV基因分型及腫瘤相關基因突變檢測，將有助于HBV感染相關肝病的個體化治療的指導和疾病轉歸的預警。在前期研究中，本課題組研發(fā)了包含HBV基因特異性擴增、HBV基因分型軟件和HBV基因突變分析軟件的乙型病毒性肝炎個體化檢測平臺，應用該平臺擴增并分析乙肝

2、患者血清、組織樣本中HBV基因組序列，可以實現(xiàn)HBV基因分型和基因突變的分析，并已取得相關知識產權。同時，在病例研究中我們發(fā)現(xiàn)了與基因型相關的特異性突變位點：RT區(qū)rt169和rt180位點和BCP區(qū)1799位點。然而在應用該個體化檢測平臺進行大樣本量檢測的過程中遇到了基因擴增穩(wěn)定性不足、部分DNA序列難以解讀、軟件兼容性問題等，因此本課題擬依據生物信息學原理優(yōu)化升級乙型病毒性肝炎個體化檢測平臺，探索DNA測序失敗的原因，并使用優(yōu)化的平

3、臺進一步研究逆轉錄酶區(qū)rt169、rt180位點和基本核心啟動子區(qū)1799位點突變在肝癌發(fā)生中的意義。
　　第一部分：乙型病毒性肝炎個體化檢測平臺優(yōu)化升級
　　目的：解決乙型病毒性肝炎個體化檢測平臺在大樣本量檢測過程中遇到的擴增穩(wěn)定性不足和軟件兼容性問題。
　　方法：采用生物信息學方法篩選符合中國地區(qū)HBV流行株特點的標準序列，序列分析確定基因分型和基因型耐藥檢測的共用序列，設計相應的擴增引物。通過多序列比對確定型特異

4、性SNP位點，據此設計基因分型算法，將HBV基因分型和基因突變分析功能整合至新軟件中。使用新軟件和Genotyping tool軟件對GenBank收錄的中國人群感染的HBV的DNA序列進行基因分型分析。
　　結果：分析獲得了HBV基因分型和基因型耐藥檢測功能共用序列，成功設計了相關基因擴增引物；HBV基因分型和基因突變分析功能整合至新軟件HBVAnalyzer；HBVAnalyzer和Genotyping tool基因分型結果一

5、致。
　　第二部分：乙肝病毒逆轉錄酶區(qū)突變分析
　　目的：了解HBV基因型與核苷（酸）類似物耐藥以及肝癌的關系，并探究rt169和rt180位點突變與肝癌發(fā)生的關系。
　　方法：用優(yōu)化升級后的擴增引物和乙型病毒性肝炎個體化檢測平臺對一組191例肝癌患者手術切除組織樣本進行HBV RT區(qū)PCR擴增、DNA測序、基因分型和基因型耐藥的檢測分析。
　　結果：從191例樣本中成功擴增了190例HBV RT區(qū)片段，基因分型

6、結果顯示本研究中肝癌患者感染的HBV以C基因型為主（71.01％），B基因型次之（28.40%）。前期研究發(fā)現(xiàn)LC/HCC組 B基因型 HBV感染者rt169和 rt180位點存在較高比例的天然同義突變，本實驗組HCC病人該位點突變率分別高達95.83%和100%。測序峰圖顯示rt169和rt180主要為雜合突變型（78.21%），與前期研究中LC/HCC組比較，兩組中雜合突變型比例相似；與前期研究中CHB組比較，雜合突變型比例顯著增加

7、（P＜0.01）。證明在疾病轉化過程中，B基因型HBV rt169和 rt180位點突變與病情發(fā)展具有相關性，可能成為預測疾病進展的新的標志物。
　　第三部分：乙肝病毒BCP/Pre C區(qū)基因序列常見突變與基因突變多樣性分析
　　目的：解析HBV BCP/Pre C區(qū)序列難以解讀的原因和解決辦法，揭示HBV BCP/Pre C區(qū)序列復雜突變與HBV基因組多樣性的關系，進一步探究前期發(fā)現(xiàn)的HBV B型特異性新突變1799G>C

8、與肝癌的關系。
　　方法：采用構建DNA文庫和單克隆測序的方法對直接測序失敗的21例病人樣本的HBVBCP/Pre C區(qū)序列進行了深度測序分析；用優(yōu)化升級后的乙型病毒性肝炎個體化檢測平臺對病人肝癌組織樣本中HBVBCP/Pre C區(qū)序列進行基因突變檢測分析。
　　結果：對21例PCR測序失敗的樣本進行PCR產物克隆測序，發(fā)現(xiàn)HCC病人感染的HBV病毒的BCP/Pre C區(qū)序列突變多達144種，包含20種缺失突變和7種插入突變

9、，其中△nt1757-1765和△nt1824-1832位點的高頻聯(lián)合缺失突變?yōu)槭状伟l(fā)現(xiàn)；每一例樣本的突變至少包含6種，說明HCC病人體內HBV基因組BCP/Pre C區(qū)序列多樣性是是由基因組的復雜突變產生的，揭示了復雜突變是導致直接測序結果無法判讀的原因。
　　針對G1799C型特異性突變的研究顯示，本組HCC病人中B基因型者G1799C突變率為85.71%。與前期發(fā)現(xiàn)的結果吻合；進一步分析顯示G1799C突變常與A1762T/