扶正活血解毒方藥對腫瘤干細(xì)胞依賴于PMNs促腫瘤轉(zhuǎn)移的作用研究.pdf

1、背景:我科著眼于中醫(yī)藥抗腫瘤的研究已有相當(dāng)長的時(shí)間，作為國家中醫(yī)腫瘤專科醫(yī)療中心，從70年代就率先開展了以扶正培本為治則的實(shí)驗(yàn)和臨床研究，相繼研究出健脾益腎顆粒、益肺清化膏等獲國家新藥證書，重點(diǎn)改善腫瘤患者臨床癥狀，提高腫瘤患者生存質(zhì)量。雖然應(yīng)用健脾補(bǔ)腎等扶正方法來治療惡性腫瘤患者，有助提高其生存質(zhì)量，延長生存期。但針對惡性腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移方面仍需要進(jìn)一步挖掘中醫(yī)中藥的作用和價(jià)值。腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤區(qū)別良性腫瘤的主要特征之一，也是導(dǎo)致患者癌

2、癥相關(guān)惡化死亡的首要原因。從90年代開始我科工作重點(diǎn)放到防治腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的研究方面，本研究基于中醫(yī)的“瘀毒”學(xué)說，在之前扶正、清熱解毒處方基礎(chǔ)之上加入活血化瘀解毒中藥，臨床應(yīng)用扶正活血解毒方藥治療晚期乳腺癌患者取得了較好療效。扶正培本與化瘀解毒兼顧已成為抑制腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要治則和研究方向，前期有關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究也不斷證實(shí)活血解毒中藥、方劑對腫瘤轉(zhuǎn)移具有一定的抑制作用。近幾年隨著對腫瘤干細(xì)胞研究以及腫瘤微環(huán)境的認(rèn)識越來越深入，干細(xì)胞

3、參與腫瘤微環(huán)境與腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)有一定的聯(lián)系。此外，腫瘤相關(guān)的炎癥與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)，尤其是腫瘤浸潤的中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，前期較多的研究中顯示中性粒細(xì)胞具有一定抑制癌細(xì)胞的作用，目前越來越多證據(jù)表明其在復(fù)雜腫瘤微環(huán)境中具有促腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的作用，其中多重復(fù)雜的分子機(jī)制和分子之間具體相關(guān)性仍有待進(jìn)一步的研究論證。本研究就是在前期扶正解毒、干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究等基礎(chǔ)上，進(jìn)一步建立乳腺癌細(xì)胞、乳腺癌干細(xì)胞以及與中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞模型分析探

4、討扶正活血解毒方藥抑制腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。
　　方法:培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞并進(jìn)行干細(xì)胞的富集分離，采用MTT法檢測扶正活血解毒方藥藤黃酸中藥單體、姜黃素中藥單體、貝母素甲中藥單體、隱丹參酮中藥單體對4T1細(xì)胞增殖抑制的情況。建立細(xì)胞模型，分別建立乳腺癌(4T1)組、4T1與中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)(PMNs)組、乳腺癌干細(xì)胞(CSLCs)組，CSLCs與PMNS共培養(yǎng)組，對照組為細(xì)胞組，實(shí)驗(yàn)組為加藥組。觀察4T1組、CSLCs組、4T1與P

5、MNs共培養(yǎng)組、CSLCs與PMNs共培養(yǎng)組，對腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響以及相關(guān)分子機(jī)制;分別建立對照組和藥物干預(yù)組（藤黃酸組、姜黃素組、貝母素甲組、隱丹參酮組），對照組為細(xì)胞模型組，實(shí)驗(yàn)組均為加入中藥干預(yù)。觀察活血解毒中藥單體對乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響以及基于干細(xì)胞和中性粒細(xì)胞分子機(jī)制。檢測:培養(yǎng)乳腺癌4T1細(xì)胞、乳腺癌干細(xì)胞、血液提取中性粒細(xì)胞并進(jìn)行共培養(yǎng)，Transwell小室檢測4T1細(xì)胞、4T1干細(xì)胞以及與中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)，各組腫瘤細(xì)胞

6、過膜轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)以及扶正活血解毒方藥作用乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù);ELISA方法檢測各細(xì)胞組、四種藥物藤黃酸、姜黃素、貝母素甲、隱丹參酮干預(yù)作用腫瘤細(xì)胞后上清中相關(guān)細(xì)胞因子u-PA、VEGF分泌水平;Western blot方法檢測各細(xì)胞組、扶正活血解毒方藥干預(yù)作用細(xì)胞后的PAI-1、TFPI-2的蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.扶正活血解毒藥物對乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用
　　研究中藥單體成分藤黃酸、姜黃素、貝母素甲、

7、隱丹參酮對乳腺癌4T1細(xì)胞的增殖抑制作用，研究結(jié)果顯示在不同的藥物濃度作用24h后，4T1細(xì)胞的生長受到不同程度抑制，結(jié)果呈濃度依賴性如圖(1.1-1.4)。根據(jù)MTT的結(jié)果結(jié)合本實(shí)驗(yàn)具體情況，貝母素選擇60μmol/L作為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的藥物作用濃度;姜黃素選擇15μmol/L作為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的藥物作用濃度;藤黃酸選擇0.5μmol/L作為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的藥物作用濃度;隱丹參酮選擇30μmol/L作為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的藥物作用濃度。
　　2.藥

8、物對4T1細(xì)胞、4T1干細(xì)胞及與PMNs共培養(yǎng)對細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的作用
　　藥物按選擇濃度對乳腺癌細(xì)胞各處理組進(jìn)行干預(yù)，姜黃素選擇15μmol/L作為藥物作用濃度;藤黃酸選擇0.5μmol/L作為藥物作用濃度;貝母素甲選擇60μmol/L作為藥物作用濃度;隱丹參酮選擇30μmol/L作為藥物作用濃度。對4T1組、CSLCs組、4T1與PMNs共培養(yǎng)組、CSLCs與PMNs共培養(yǎng)組分別進(jìn)行transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。將四組細(xì)胞組分別

9、加入四種藥物進(jìn)行干預(yù)作用24h后，結(jié)果顯示，在藥物作用方面:藥物干預(yù)組細(xì)胞穿過的數(shù)目較對照組轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)量減少(P＜0.05)。對照組總轉(zhuǎn)移數(shù)最多，為514.80，各組平均128.70。姜黃素干預(yù)組細(xì)胞總轉(zhuǎn)移數(shù)最少，為369.40，各組平均92.35。各組轉(zhuǎn)移細(xì)胞總數(shù)之間比較:空白組＞貝母素甲干預(yù)組＞藤黃酸干預(yù)組＞隱丹參酮干預(yù)組＞姜黃素干預(yù)組，扶正活血解毒方藥藤黃酸、姜黃素、貝母素甲、隱丹參酮均有不同程度抑制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。在細(xì)胞模

10、型方面:乳腺癌4T1組轉(zhuǎn)移平均數(shù)117.20;CSLCs組轉(zhuǎn)移平均數(shù)為133.40;4T1與PMNs共培養(yǎng)組轉(zhuǎn)移平均數(shù)為126.00;CSLCs與PMNs共培養(yǎng)組轉(zhuǎn)移平均數(shù)為138.20。各組之間比較:4T1組總轉(zhuǎn)移數(shù)最少，CSLCs與PMNs共培養(yǎng)組轉(zhuǎn)移數(shù)最多。各細(xì)胞模型組間比較:CSLCs與PMNs共培養(yǎng)組＞CSLCs組＞4T1與PMNs共培養(yǎng)組＞4T1組，CSLCs與PMNs共培養(yǎng)組較4T1組增多，P＜0.05，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

11、CSLCs組較4T1組增多，P＜0.05，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4T1與PMNs共培養(yǎng)組較4T1組增多，P＜0.05，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4T1與PMNs共培養(yǎng)組較CSLCs組減少，P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.藥物對4T1細(xì)胞、干細(xì)胞及共培養(yǎng)條件下腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)分子活性的影響
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:細(xì)胞上清中uPA分子:4T1與PMNs共培養(yǎng)組較4T1組增高(P＜0.05)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4T1與PMNs共培養(yǎng)組較CS

12、LCs組略有增高，但(P＞0.05)，結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。CSLCs組較4T1組增高(P＜0.05)，CSLCs與PMNs共培養(yǎng)組較CSLCs組增高(P＜0.05)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。CSLCs與PMNs共培養(yǎng)組較4T1組增高(P＜0.05)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。藥物干預(yù)處理組藤黃酸、姜黃素、貝母素甲、隱丹參酮較對照組均降低(P＜0.05)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。細(xì)胞上清中VEGF分子;4T1與PMNs共培養(yǎng)組較4T1組增高(P＜0.05)，結(jié)

13、果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。CSLCs組較4T1組增高(P＜0.05)，CSLCs與PMNs共培養(yǎng)組較CSLCs組增高(P＜0.05)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。CSLCs與PMNs共培養(yǎng)組較4T1組增高(P＜0.05)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。藥物干預(yù)處理組藤黃酸、姜黃素、貝母素甲、隱丹參酮較對照組降低(P＜0.05)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4.活血解毒方藥對4T1細(xì)胞、干細(xì)胞及共培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:測定提取細(xì)胞蛋

14、白中PAI-1的表達(dá):4T1與PMNs共培養(yǎng)組較4T1組表達(dá)增高(P＜0.05)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4T1與PMNs共培養(yǎng)組較CSLCs組略有增高，但(P＞0.05)，結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CSLCs組較4T1組增高(P＜0.05)，CSLCs與PMNs共培養(yǎng)組較CSLCs組增高(P＜0.05)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。CSLCs與PMNs共培養(yǎng)組較4T1組增高(P＜0.05)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。藥物干預(yù)處理組藤黃酸、姜黃素、貝母素甲、隱丹參酮較

15、對照組蛋白表達(dá)降低(P＜0.05)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。測定蛋白中TFPI-2的含量表達(dá):4T1與PMNs共培養(yǎng)組較4T1組降低(P＜0.05)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。CSLCs組較4T1組降低(P＜0.05)，CSLCs與PMNs共培養(yǎng)組較CSLCs組降低(P＜0.05)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。CSLCs與PMNs共培養(yǎng)組較4T1組降低(P＜0.05)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。藥物干預(yù)處理組藤黃酸、姜黃素、貝母素甲、隱丹參酮均較對照組增高(P＜0.0

16、5)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:干細(xì)胞是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的先決條件，相比普通乳腺癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移能力。研究認(rèn)為干細(xì)胞與存在于腫瘤微環(huán)境中的中性粒細(xì)胞相互作用促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生滾動粘附繼而外滲到達(dá)遠(yuǎn)處組織，形成復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。研究結(jié)果表明基于中醫(yī)“瘀毒”學(xué)說扶正活血解毒方藥對腫瘤細(xì)胞有一定的抑制增殖作用，抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用，其作用機(jī)制可能與活血解毒方藥調(diào)節(jié)血液粘度，降低細(xì)胞因子uPA、VEGF的表達(dá)，作用于干細(xì)胞，影響中性粒細(xì)胞分化