HIF-PHF8-AR軸在去勢抵抗前列腺癌發(fā)生中的作用機制研究.pdf

1、研究背景：去勢治療仍然是針對局部進展和轉移性前列腺癌的主要手段。遺憾的是，雖然大多數(shù)前列腺癌患者最初對去勢治療反應敏感，但許多腫瘤最終都會從激素敏感性前列腺癌（HDPC）進展為去勢抵抗性前列腺癌（CRPC）。近年的研究報道提示雄激素受體AR在CRPC進展中發(fā)揮關鍵角色。而去勢誘導的低氧可以促進AR轉錄激活和CRPC進展，植物同源結構域鋅指蛋白8（PHF8）作為組蛋白去甲基化酶家族中一員，高表達于包括前列腺癌在內(nèi)的多種腫瘤中。我們現(xiàn)在的研

2、究設計基于探索PHF8在去勢誘導的低氧和AR轉錄激活過程中扮演的關鍵作用。
　　研究方法：第一，免疫組織化學技術用于分析97例病人組織樣本，包括16例良性前列腺增生（BPH），16例前列腺上皮內(nèi)瘤變（PIN）和65例來自于組織芯片的前列腺癌病人?；诿庖呓M化染色評分，65例前列腺癌病人被分成PHF8高表達組（33例）和低表達組（32例）。Pearson卡方檢驗分析PHF8表達與腫瘤相關變量的關系。實施Kaplan-Meier曲線對

3、隨訪數(shù)據(jù)進行生存分析。第二，經(jīng)直腸彩色超聲多普勒用于分析去勢前后前列腺癌組織血供情況。免疫組化和免疫印跡實驗用于比較14例進展性前列腺癌病人去勢前后PHF8, HIF1α and HIF2α表達水平差異。第三，在缺氧條件下(1％O2)培養(yǎng)三種前列腺癌細胞系LNCaP,22RV1 and DU145分別0,12和24h，用免疫印跡和熒光定量PCR技術分別檢測PHF8表達和mRNA表達。為了檢測低氧誘導的 PHF8表達是依賴于 HIF家族轉

4、錄因子調(diào)控，在 LNCaP細胞中用shRNAs敲低HIF1?或HIF2?表達，然后低氧處理??h觀察PHF8表達變化。通過熒光素酶報告系統(tǒng)檢測HIF轉錄因子是否直接調(diào)控PHF8表達。第四，用免疫印跡實驗比較常氧和低氧條件下PHF8底物H3K9me1, H3K9me2和H4K20me1的整體水平，同時在LNCaP和PC-3細胞中分析PHF8敲低對上述甲基化蛋白水平的影響。最后，我們用PHF8過表達質(zhì)粒瞬時轉染LNCaP和PC-3細胞，用免

5、疫熒光染色分析常氧(21%O2)和低氧(1%O2)條件下PHF8過表達使組蛋白去甲基化的能力。第五，用免疫印跡和熒光定量PCR技術檢測了PHF8敲低對激素誘導的PSA和NKX3.1轉錄激活的影響。染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）用于分析在激素或去激素處理條件下 PHF8對AR的轉錄激活作用以及低氧條件下PHF8招募到PSA和NKX3.1啟動子區(qū)域情況。第六，在293FT細胞中過表達GFP標簽的AR和Flag標簽的PHF8野生型或突變型質(zhì)粒；

6、在激素或去激素條件下處理24h，用GFP或Flag抗體實施免疫共沉淀實驗。PHF8與 AR的內(nèi)源性免疫共沉淀實驗在 LNCaP細胞中進行。最后，將4xUAS-TK-luc報告基因，Gal4 DNA綁定結構域和AR(Gal-AR)，以及不同濃度梯度（照提示）的PHF8野生型或突變型（H247A）質(zhì)粒轉染入Hela細胞中，用熒光素酶報告實驗檢測PHF8對AR的轉錄激活作用。
　　研究結果:
　　1. PHF8高表達與高的Glea

7、son分級和不良預后相關。在BPH到PIN再到高Gleason評分的前列腺癌患者組織中，PHF8表達呈逐漸上調(diào)的趨勢。相比于PHF8低表達組，PHF8高表達組包括更多Gleason評分8-10的低分化前列腺癌患者。低Gleason評分腫瘤中PHF8呈現(xiàn)更多胞質(zhì)染色，而在高Gleason評分腫瘤中 PHF8呈現(xiàn)更多胞核染色。PHF8在 BPH、激素敏感性前列腺癌和激素抵抗性前列腺癌組織中的表達也是與分化級別高度相關，在激素抵抗性前列腺癌組

8、織中能觀察到最高的PHF8表達水平。
　　2.前列腺癌PHF8高表達與去勢治療誘導的低氧相關。去勢治療減少了前列腺癌組織血流信號。同時在去勢治療后的臨床樣本中也觀察到HIF1α, HIF2α和PHF8分布于胞質(zhì)和胞核，并且呈高水平表達。
　　3.低氧誘導前列腺癌細胞PHF8高表達。三種前列腺癌細胞系LNCaP,22RV1和DU145分別低氧(1%O2)處理0,12和24h， PHF8蛋白和mRNA水平呈升高趨勢。敲低HIF1

9、α或HIF2α表達均降低了PHF8表達。HIF1?和HIF2?均能強烈誘導帶有-1281到+1長度PHF8啟動子的熒光素酶報告子轉錄激活。在低氧條件下，轉錄因子HIFs能綁定到PHF8的啟動子區(qū)域激活其轉錄。
　　4.低氧誘導的PHF8發(fā)揮去甲基化酶功能調(diào)節(jié)整體組蛋白甲基化水平。在LNCaP和293FT細胞中，低氧誘導PHF8表達并且導致PHF8底物H3K9me1, H3K9me2和 H4K20me1水平的下調(diào)，但沒有影響非 PH

10、F8底物 H3K9me3水平。在LNCaP和PC-3細胞中，敲低PHF8表達導致H3K9me1/2和H4K20me1水平的上調(diào)，但沒有增加H3K9me3表達。在常氧(21%O2)和低氧(1%O2)條件下，在LNCaP和PC-3細胞中過表達PHF8誘導了H3K9me1, H3K9me2和H4K20me1水平的下調(diào)，但沒有影響H3K9me3表達水平。
　　5. PHF8招募到AR靶基因調(diào)控其轉錄激活。在LNCaP和VCaP細胞中PHF

11、8敲低顯著減弱了DHT誘導的PSA和NKX3.1的轉錄激活。雖然與PSA和NKX3.1相比程度稍弱，PHF8敲低也顯著減弱了DHT誘導的AR的轉錄激活；同樣的結果也可以在去激素處理的22RV1細胞中觀察到。在激素作用下，PHF8可以招募到AR靶基因PSA和NKX3.1的啟動子上調(diào)控其轉錄。
　　6. PHF8與AR相互作用轉錄激活AR是酶活性依賴性的。在293FT和LNCaP中分別檢測到外源性和內(nèi)源性PHF8和AR的相互作用。共表

12、達PHF8以劑量依賴方式增強AR轉錄活性。PHF8作為AR共刺激因子依賴于其去甲基化酶活性，因為在PHF8(H247A)突變型中沒有觀察到這種效應。
　　研究結論：綜上所述，結果提示HIF/PHF8/AR信號軸的存在促進了前列腺癌進展。提出前列腺癌去勢治療誘導產(chǎn)生低氧微環(huán)境激活HIFs表達，而HIFs激活又促進PHF8表達。PHF8上調(diào)增強AR轉錄活性，促進前列腺癌進展，其機制至少部分通過激活AR信號通路。研究提示HIF/PHF8