雄激素受體(AR)上調(diào)RNA結(jié)合蛋白QKI在去勢(shì)抵抗性前列腺癌中的作用.pdf

1、背景：在我國(guó)，前列腺癌占所有男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第3位。前列腺癌發(fā)病隱匿，早期多無(wú)典型癥狀，當(dāng)被發(fā)現(xiàn)時(shí)大多已是晚期。使前列腺癌的早期預(yù)防和診斷顯得尤為困難。前列腺癌的早期診斷主要是根據(jù)血清中PSA的含量，直腸指診也是一個(gè)主要的輔助手段。前列腺癌內(nèi)分泌治療效果顯著，但是經(jīng)過(guò)12-18月的雄激素剝奪治療后，多數(shù)病人會(huì)不可避免地轉(zhuǎn)變?yōu)槿?shì)抵抗性前列腺癌（Castration Resistant Prostate Cancer，CRPC）

2、。去勢(shì)抵抗性前列腺癌預(yù)后差，患者生活質(zhì)量嚴(yán)重下降，給患者帶來(lái)了十分嚴(yán)重的后果。因此，明晰去勢(shì)抵抗性前列腺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制，有可能為前列腺癌的臨床治療提供新的方法。雄激素受體在去勢(shì)抵抗性前列腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著十分重要的作用。目前，CRPC治療的靶點(diǎn)均集中在AR調(diào)控上游，而從CRPC的發(fā)生機(jī)制來(lái)看，僅僅對(duì)AR通路上游的抑制，并不能阻止AR對(duì)下游基因的過(guò)度活化。因此，從AR信號(hào)通路下游著手，或可探尋增敏 CRPC細(xì)胞的潛在治療靶點(diǎn)。

3、>　　QKI（quaking）是屬于STAR（signal transduction and activation of RNA）家族的一種RNA結(jié)合蛋白，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中參與髓鞘發(fā)育。QKI基因不同突變體小鼠可以表現(xiàn)在出生前死于心血管肌肉系統(tǒng)發(fā)育障礙，或于出生后10天表現(xiàn)為快速的震顫以及到了成年強(qiáng)直性驚厥的發(fā)作而得名。除了在神經(jīng)系統(tǒng)中對(duì)于髓鞘的形成發(fā)揮重要功能以外，QKI蛋白還參與了細(xì)胞的大多數(shù)生物學(xué)過(guò)程，比如血管發(fā)生、細(xì)胞凋亡、

4、細(xì)胞黏附、細(xì)胞生長(zhǎng)及形態(tài)形成和器官發(fā)生等。目前研究發(fā)現(xiàn)，QKI可能調(diào)控多達(dá)1430個(gè)下游靶基因，而其中有24％的基因參與細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移，高度提示QKI可能在腫瘤的增殖與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。AR與QKI之間是否存在調(diào)控關(guān)系，如果存在調(diào)控關(guān)系，那么對(duì)前列腺癌的發(fā)生發(fā)展有什么的作用目前尚未見(jiàn)到相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。因此，明確二者之間的調(diào)控關(guān)系以及對(duì)前列腺癌的影響將有助于進(jìn)一步理解前列腺癌的演變情況，也有助于提供新的治療策略。
　　目的：

5、　　1、了解不同前列腺癌細(xì)胞系以及臨床腫瘤組織樣本中AR和QKI的分子和蛋白表達(dá)水平，明確二者是否有潛在的調(diào)控關(guān)系存在。
　　2、觀察表達(dá)內(nèi)源性AR的前列腺癌細(xì)胞系在ADT干預(yù)情況下，前列腺癌細(xì)胞中AR和QKI的表達(dá)變化，以及CRPC細(xì)胞中AR突變體的變化情況。
　　3、明確沉默AR對(duì)QKI表達(dá)的影響，以及對(duì)不同前列腺癌細(xì)胞周期和凋亡功能的影響。
　　4、明確沉默QKI對(duì)AR表達(dá)是否存在影響，以及對(duì)細(xì)胞周期和功能的影響

6、，初步探討存在影響可能的機(jī)制。
　　5、探究沉默QKI能否影響CRPC對(duì)抗雄藥物比卡魯胺的敏感性。
　　方法和結(jié)果：
　　1、提取臨床腫瘤組織樣本中的蛋白以及不同前列腺癌細(xì)胞系中的蛋白和分子，分別通過(guò)qRT-PCR和western blotting觀察不同前列腺癌細(xì)胞系中AR和QKI的mRN A和蛋白表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)在AR高表達(dá)的腫瘤組織樣本以及前列腺癌細(xì)胞系中，QKI的表達(dá)也明顯增高。這表明AR也許能夠調(diào)控QKI的表達(dá)

7、。通過(guò)對(duì)QKI啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，可能有AR潛在的結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)對(duì)QKI啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合位點(diǎn)分析，存在AR的結(jié)合位點(diǎn)，而且AR能夠正向調(diào)控QKI的活性。因此，AR可以正向調(diào)控QKI的表達(dá)。
　　2、碳吸附血清培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞以排除其它激素和細(xì)胞因子對(duì)AR的活化作用。我們采用碳吸附血清和生理濃度二氫睪酮來(lái)驗(yàn)證雄激素對(duì)AR活化的調(diào)控。分別通過(guò)qRT-PCR和western blotting來(lái)觀察不同前列腺癌細(xì)胞

8、系中AR和QKI的mRNA和蛋白表達(dá)。通過(guò)qRT-PCR來(lái)觀察AR突變體以及靶基因在去雄條件下的表達(dá)變化。發(fā)現(xiàn)在ADT情況下，前列腺癌細(xì)胞系LNCaP和C4-2細(xì)胞中的AR和QKI表達(dá)均下降，加入二氫睪酮后培養(yǎng)，AR和QKI的表達(dá)有一定程度的恢復(fù)。進(jìn)一步驗(yàn)證了AR能夠正向調(diào)控QKI的表達(dá)。通過(guò)對(duì)C4-2中AR突變體及靶基因的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，突變體分子表達(dá)水平出現(xiàn)了與此相反的變化。表明在去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞中，AR突變體能夠在沒(méi)有雄激素存在的

9、情況下自我活化，從而有利于細(xì)胞的存活。
　　3、通過(guò)siRNA片段以及脂質(zhì)體2000細(xì)胞轉(zhuǎn)染來(lái)沉默 AR的表達(dá)，分別通過(guò)qRT-PCR和western blotting來(lái)檢測(cè)細(xì)胞中AR、QKI和PSA的mRNA和蛋白表達(dá)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)檢測(cè)沉默AR對(duì)前列腺癌細(xì)胞周期和凋亡功能的影響。發(fā)現(xiàn)沉默AR后QKI的蛋白和分子表達(dá)水平均下降，細(xì)胞發(fā)生周期阻滯，細(xì)胞凋亡增加。在細(xì)胞周期阻滯上，LNCaP和C4-2細(xì)胞表現(xiàn)不同，前者主要是發(fā)生了

10、G1/S期阻滯，后者為G2/M阻滯。UBE2c是G2/M的主要調(diào)控分子，C4-2中該基因表達(dá)明顯增高，這可能是C4-2發(fā)生G2/M阻滯的原因。
　　4、通過(guò)siRNA片段以及脂質(zhì)體2000細(xì)胞轉(zhuǎn)染來(lái)沉默QKI的表達(dá)，分別通過(guò)qRT-PCR和western blotting來(lái)檢測(cè)細(xì)胞中AR、QKI、PSA和HSP90的mRNA和蛋白表達(dá)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)檢測(cè)沉默QKI對(duì)前列腺癌細(xì)胞周期和凋亡功能的影響。發(fā)現(xiàn)沉默AR后QKI的蛋白和分

11、子表達(dá)水平均下降，HSP90分子表達(dá)水平明顯下降。兩株細(xì)胞均發(fā)生周期阻滯，細(xì)胞凋亡增加。在細(xì)胞周期阻滯上，LNCaP和C4-2細(xì)胞表現(xiàn)不同，前者主要是發(fā)生了G1/S期阻滯，后者為G2/M阻滯。此外還檢測(cè)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡蛋白caspase-12以及G1/S期蛋白P27，G2/M期蛋白P21。結(jié)果表明，凋亡蛋白和周期蛋白均明顯增高。
　　5、通過(guò)MTT來(lái)檢測(cè)細(xì)胞增殖功能。發(fā)現(xiàn)沉默了QKI后，CRPC細(xì)胞對(duì)抗雄藥物比卡魯胺的敏感性增加。