柔嫩艾美耳環(huán)蟲真核翻譯起始因子3d(eIF3d)基因的研究.pdf

1、雞球蟲病是規(guī)模化養(yǎng)雞場(chǎng)最容易發(fā)生的寄生蟲病，它的病原體為艾美耳屬雞球蟲。雞球蟲病能夠?qū)е虑蓊惖纳L(zhǎng)緩慢和飼料轉(zhuǎn)化率降低，間接地引起養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)損失，如果嚴(yán)重時(shí)，則直接導(dǎo)致雞只大量死亡，從而造成養(yǎng)殖戶的重大經(jīng)濟(jì)損失。目前，有報(bào)道表明，每年因雞球蟲病給全世界的養(yǎng)殖業(yè)造成了約5億英鎊的巨大損失。當(dāng)前在禽類的養(yǎng)殖業(yè)中主要還是依靠藥物來預(yù)防控制雞球蟲病，但是球蟲抗藥性的問題日益突出。同時(shí)雞體藥物殘留和藥物價(jià)格過高等問題也促使人們?nèi)ふ倚碌姆椒▉矸乐坞u

2、球蟲病。雞球蟲屬于頂復(fù)器原蟲，是專性細(xì)胞內(nèi)寄生蟲，生活史復(fù)雜，包括細(xì)胞內(nèi)階段和細(xì)胞外階段，都需要入侵雞腸道上皮細(xì)胞，在腸道細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育繁殖。子孢子是雞球蟲入侵腸道細(xì)胞的第一個(gè)發(fā)育階段，子孢子如何入侵，目前還不是很清楚。對(duì)子孢子階段差異表達(dá)基因的研究，有助于了解雞球蟲的入侵和生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制，可為新疫苗和新藥物的研制提供新思路。本研究室前期利用抑制性消減雜交和cDNA微陣列技術(shù)篩選了柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)子孢子發(fā)育

3、階段的差異表達(dá)基因，獲得了一些ESTs。本文即以致病力最強(qiáng)的柔嫩艾美耳球蟲為研究對(duì)象，對(duì)獲得的其中一個(gè)子孢子差異表達(dá)基因EST(克隆號(hào)：ZB7-B08，GenBank登陸號(hào)：ES351380.1)進(jìn)行克隆、表達(dá)及分析，并對(duì)其功能、免疫保護(hù)力等進(jìn)行了研究。
　　 ⑴柔嫩艾美耳球蟲新基因ZB7-B08 cDNA全長(zhǎng)的克隆及分析。本研究選擇柔嫩艾美耳球蟲子孢子差異表達(dá)基因EST(克隆號(hào)：ZB7-B08)，通過RACE技術(shù)獲得了該差異基

4、因含一個(gè)完整開放閱讀框的全長(zhǎng)cDNA序列。在NCBI網(wǎng)站經(jīng)同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該基因與犬新孢蟲真核翻譯起始因子3第7亞單位具有68％的相似性，推測(cè)該基因?yàn)槿崮郯蓝蛳x真核翻譯起始因子3基因(eukaryotic initiation factor3，eIF3)。此外，利用生物信息學(xué)軟件對(duì)該基因的跨膜結(jié)構(gòu)、保守域、信號(hào)肽、抗原位點(diǎn)、以及疏水性等進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示該基因開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)編碼571個(gè)氨

5、基酸，理論分子量約為65 KD，符合eIF3中d亞單位的命名規(guī)則，故命名該基因?yàn)镋teIF3d，無跨膜結(jié)構(gòu)，也無信號(hào)肽，但有大量抗原位點(diǎn)。利用Real-time PCR檢測(cè)了該基因在柔嫩艾美耳球蟲4個(gè)不同發(fā)育階段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子)的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，該基因在子孢子和第二代裂殖子階段表達(dá)量相對(duì)較高，其中在第二代裂殖子階段表達(dá)最高。
　　 ⑵柔嫩艾美耳球蟲eIF3d基因的表達(dá)及抗原性驗(yàn)證。將目的基因

6、EteIF3d連接到pET28b(+)原核表達(dá)載體上，成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28b-EteIF3d后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE分析重組蛋白，分子量大約69KD，在加入IPTG誘導(dǎo)后6h即達(dá)到高峰，且重組蛋白主要以無活性的包涵體形式出現(xiàn)，用尿素將其變性后，過柱純化獲得重組蛋白His-EteIF3d，經(jīng)Western-blot分析，結(jié)果表明重組蛋白EteIF3d具有良好的抗原性。為進(jìn)一步對(duì)其功能進(jìn)行研

7、究，需要將其進(jìn)行分泌表達(dá)，因此，將該基因連接到真核畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-EteIF3d后轉(zhuǎn)化GS115酵母感受態(tài)細(xì)胞，利用甲醇作為唯一碳源，誘導(dǎo)表達(dá)后獲得了有活性的可溶性蛋白，經(jīng)Western-blot驗(yàn)證，畢赤酵母表達(dá)的EteIF3d蛋白具有良好的抗原性。
　　 ⑶柔嫩艾美耳球蟲eIF3d基因與入侵發(fā)育相關(guān)分析。采用間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)，將柔嫩艾美耳球蟲子孢子體外接種雞胚成纖維細(xì)胞(DF-1)后

8、，利用制備的兔抗EteIF3d多克隆抗體為一抗，分析EteIF3d在蟲體不同發(fā)育階段的定位、表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在子孢子入侵不同時(shí)間段，EteIF3d表達(dá)量逐漸呈增加趨勢(shì)，并且剛?cè)肭旨?xì)胞時(shí)有向頂端聚集的趨勢(shì)，隨著子孢子的不斷發(fā)育，表達(dá)量也呈上升趨勢(shì)，到裂殖子階段表達(dá)量達(dá)到最大。推測(cè)該基因在子孢子、裂殖子的發(fā)育過程中發(fā)揮一定作用，同時(shí)也可能和子孢子、裂殖子入侵腸道上皮細(xì)胞有一定關(guān)系。為了更進(jìn)一步確認(rèn)該蛋白與子孢子入侵的關(guān)系，隨后又進(jìn)行了該

9、蛋白的體外抑制實(shí)驗(yàn)，將純化后的兔抗EteIF3d多抗IgG以不同濃度(50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和400μg/mL)與子孢子孵育2h后接入DF-1細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)子孢子的入侵率。結(jié)果顯示，隨著抗體濃度的升高，子孢子侵入DF-1細(xì)胞的入侵率逐漸降低，說明該蛋白與子孢子入侵宿主細(xì)胞具有一定的關(guān)系。
　　 ⑷EteIF3d基因編碼蛋白對(duì)雞球蟲的免疫保護(hù)性實(shí)驗(yàn)。為了驗(yàn)證EteIF3d基因編碼的蛋白是否對(duì)雞

10、球蟲有較好的免疫保護(hù)效果，將重組蛋白His-EteIF3d分別以50μg/羽、100μg/羽分兩組對(duì)雛雞進(jìn)行肌肉注射免疫，二免后7d用柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊按1×104/羽給雞灌服，并在不同的時(shí)間段采集雞盲腸和脾臟檢測(cè)不同的指標(biāo)，最后綜合分析評(píng)價(jià)該蛋白的免疫保護(hù)性效果。結(jié)果顯示。在增重、卵囊減少率、病變記分等方面，免疫組都優(yōu)于感染對(duì)照組，并且高劑量免疫組的效果明顯更好；在體液免疫方面，His-EteIF3d免疫雞后能產(chǎn)生特異性抗體，在