人骨髓和胎盤基蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞在低氧無血清的SIS上生物學(xué)特性的對比.pdf

1、目的：在小腸粘膜下層（small intestinal submucosa, SIS）三維培養(yǎng)體系中，比較人骨髓和胎盤基蛻膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞（ mesenchymal stem cells，MSCs）在低氧無血清的培養(yǎng)條件下細(xì)胞的生物學(xué)特性，為篩選更優(yōu)越的組織工程種子細(xì)胞提供實驗依據(jù)。方法：無菌條件下分離提取人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells,）以及人胎盤基蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞（pace

2、ntal decidua basalis-mesenchymal stem cells, PDB-MSCs）并進行體外擴增培養(yǎng)，并檢測人 BM-MSCs和 PDB-MSCs表面標(biāo)記物（CD34、CD11b、CD19、CD90、CD44和 CD105）的表達情況。同時在成脂、成骨和成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)環(huán)境下進行誘導(dǎo)分化來鑒定 BM-MSCs和PDB-MSCs的多向分化潛能。以鑒定BM-MSCs和PDB-MSCs的多向分化潛能。然后取PDB-MS

3、Cs和BM-MSCs接種于SIS上，共培養(yǎng)7天后在掃瞄電鏡下（scanning electron microscope， SEM）下觀察MSCs在SIS上的形態(tài)特征，然后將其隨機分為4組：分別是 BM-MSCs常氧有血清組（ normoxia and complete medium， N/CM）、 BM-MSCs低氧無血清組（ hypoxia and serum deprivation, H/SD）、PDB-MSCs常氧有血清組（nor

4、moxia and complete medium，N/CM）和 PDB-MSCs低氧無血清組（hypoxia and serum deprivation, H/SD）。其中常氧條件下，體外三氣培養(yǎng)箱氧含量為21％，低氧條件下，氧含量為1%；有血清條件下含F(xiàn)BS10%，無血清條件下，含F(xiàn)BS0%。采用CCK8的檢測方法分別檢測PDB-MSCs和BM-MSCs復(fù)合物分別在低氧無血清、常氧有血清條件下培養(yǎng)0h，6h，12h，24h后的增殖情

5、況；并采用凋亡流式細(xì)胞盒（ Annexin V/propidium iodide，AV/PI）檢測觀察BM-MSCs和PDB-MSCs復(fù)合物分別在低氧無血清、常氧有血清條件下培養(yǎng)6h，48h，72h后的凋亡情況；并采用 Q-PCR檢測BM-MSCs和PDB-MSCs復(fù)合物在低氧無血清、常氧有血清中處理72h后的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） mRNA的表達情況；We

6、stern Blot檢測兩種細(xì)胞在低氧無血清條件下72h抗凋亡相關(guān)蛋白 AKT、ERK1/2、Bcl2蛋白表達情況。結(jié)果：本實驗中PDB-MSCs和BM-MSCs均成功于骨髓和胎盤組織中提取并進行了體外擴增，光學(xué)顯微鏡下P3代以后，兩種MSCs形態(tài)均為長梭形的成纖維樣細(xì)胞，并呈“魚群樣”緊密排列。通過流式鑒定提示兩種細(xì)胞均表達了抗原CD73、CD90以及CD105，均不表達表面抗原CD34、CD11b和CD19。此外，兩種細(xì)胞均可向成骨

7、、成脂和成軟骨分化，具有多向分化性能。SEM掃描電鏡下觀察在SIS小腸黏膜下層上BM-MSCs和PDB-MSCs與SIS具有良好的生物相容性，在SIS均表現(xiàn)為長梭形，并分泌大量基質(zhì)附于支架三維結(jié)構(gòu)上。CCK8檢測提示24h內(nèi)在低氧無血清條件可促進 BM-MSCs以及PDB-MSCs增值（P<0.05）且 PDM-MSCs耐受低氧能力更強（P<0.05）。AV/PI檢測提示在低氧無血清處理的48小時內(nèi)，PDB-MSCs以及BM-MSCs均

8、能夠耐受凋亡（P＞0.05），差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在低氧無血清處理72h, PDB-MScs凋亡率較BM-MSCs在低氧無血清條件下更低（P<0.05）,提示PDB-MSCs與BM-MSCs相比，表現(xiàn)出更好的耐受凋亡。Q-PCR檢測兩種細(xì)胞中在低氧無血清條件下 VEGF表達量，提示 PDB-MSCs表達量高于BM-MSCs。Western Blot檢測顯示低氧無血清條件下PDB-MSCs表達抗凋亡蛋白ERK1/2、AKT、BCL2含量明顯